近日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)果蔬園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用全國重點實驗室、園藝林學(xué)學(xué)院郭文武教授和張飛教授團(tuán)隊合作研究成果以“Transcriptional regulation of thorn tip sclerification in plants”為題在PNAS發(fā)表。研究以柑橘枝刺為模式系統(tǒng)，首次鑒定植物枝刺頂部硬化核心調(diào)控基因SHORT AND SOFT THORN 1（SST1），揭示了SST1-NST1/SND1模塊促進(jìn)次生細(xì)胞壁增厚、木質(zhì)素生物合成的調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)該分子調(diào)控在皂莢、三角梅等多種植物枝刺頂部硬化過程中具有保守性，為植物無枝刺分子育種提供了重要基因資源。

 

　　植物因其固著生活方式，在長期自然選擇中演化出各種“武器”防御植食動物。植物“防御武器”典型代表包括枝條變態(tài)發(fā)育而來的枝刺（thorn）、表皮及皮下組織突起形成的皮刺（prickle）、葉片變態(tài)發(fā)育形成的葉刺（spine）等。這些刺均具有堅硬且尖銳的頂部，積累木質(zhì)素等物質(zhì)。刺頂部硬化的分子機(jī)制尚未解析。

 

　　柑橘為蕓香科果樹，幾乎所有實生柑橘樹，特別是用于嫁接的實生砧木苗均具有枝刺。枝刺是童期的特征性狀，但甜橙、檸檬、柚等柑橘類型進(jìn)入成年態(tài)后，仍具有枝刺。枝刺影響嫁接、修剪和果實采收等果園管理；鋒利的刺尖還會刺傷植物，導(dǎo)致病菌傳播、影響果實外觀品質(zhì)和貯藏性能。枝刺在多倍體材料中更為明顯，其粗且長的特點限制了這些多倍體抗性材料在生產(chǎn)中應(yīng)用。

 

　　前期研究發(fā)現(xiàn)，柑橘枝刺頂部具有木質(zhì)化特征，而基部仍然保留細(xì)胞分裂活性，頂部和基部具有明確界限（Zhang et al., 2020）。同一器官頂部-基部明顯差異發(fā)育的特點，為解析刺的特異木質(zhì)化提供了絕好的成對研究材料。利用此特點，該研究首先通過枝刺頂部和基部比較轉(zhuǎn)錄組，發(fā)掘頂部優(yōu)勢表達(dá)基因；利用高效遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，進(jìn)行CRISPR-Cas9基因編輯篩選，獲得了控制枝刺伸長和頂部硬化的關(guān)鍵基因SST1，其編碼MYB家族轉(zhuǎn)錄因子。

 

　　基因編輯創(chuàng)制的sst1突變體具有刺短且軟的特點。進(jìn)一步分析顯示，這些突變體的刺中木質(zhì)素和纖維素含量顯著下降。值得一提的是，sst1植株整體生長未受影響，具有潛在應(yīng)用價值。其原因在于，SST1基因只特異在枝刺頂部的維管組織表達(dá)，葉片、莖桿、側(cè)枝等均未檢測到其表達(dá)。此外，SST1基因表達(dá)完全依賴于柑橘枝刺身份基因—TCP家族基因TI1和TI2。

 

　　SST1的作用機(jī)制是什么？研究通過整合比較sst1突變體枝刺轉(zhuǎn)錄組及刺頂部-基部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)大量與木質(zhì)素生物合成以及次生壁增厚相關(guān)基因受SST1調(diào)控。其中，已報道調(diào)控木質(zhì)素合成與次生壁加厚的“主控開關(guān)”基因——NST1 和 SND1在sst1突變體顯著下調(diào)。利用CRISPR-Cas9多基因編輯系統(tǒng)同時敲除NST1和SND1，獲得的nst1 snd1雙突變體枝刺變軟。進(jìn)一步通過木質(zhì)素染色和透射電鏡分析發(fā)現(xiàn)，sst1突變體、nst1 snd1雙突變體均表現(xiàn)為刺頂部木質(zhì)素積累減少、次生細(xì)胞壁變薄等特點。

 

　　為發(fā)掘枝刺硬化過程中SST1、NST1與SND1共同下游基因，研究利用nst1 snd1雙突變體枝刺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，重點關(guān)注同時滿足以下條件的基因：nst1 snd1雙突變體刺下調(diào)、sst1突變體刺下調(diào)、野生型刺頂部上調(diào)。這些基因與植物次生壁、木質(zhì)素、纖維素生物合成與調(diào)控相關(guān)。分子生化實驗證明，SST1直接結(jié)合NST1和SND1啟動子。由于柑橘童期長和基因組高度雜合，研究還開發(fā)了一種新的遺傳互補(bǔ)方法，即在敲除SST1的基因編輯載體上，增加SST1啟動子驅(qū)動SND1的表達(dá)框，發(fā)現(xiàn)SND1基因表達(dá)能回補(bǔ)sst1突變體枝刺木質(zhì)素積累缺陷，從而明確了SST1在硬刺形成中的“上游指揮官”身份。

 

　　研究還進(jìn)一步揭示了植物枝刺頂部硬化分子調(diào)控機(jī)制的進(jìn)化保守性。鑒定了蕓香科的澳指檬、酒餅簕，紫茉莉科的三角梅以及豆科的皂角的SST1同源基因，發(fā)現(xiàn)這些植物的SST1同源基因都在枝刺中特異高表達(dá)（圖5）。綜上，該研究構(gòu)建了以SST1為核心的刺尖硬化調(diào)控通路，SST1作為刺身份基因TI1下游，在刺尖特異表達(dá)，其直接激活NST1/SND1，調(diào)控次生細(xì)胞壁加厚和木質(zhì)素生物合成。研究不僅深化了對植物防御性器官分化機(jī)制的理解，也為具刺果樹分子育種提供了重要基因資源。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘團(tuán)隊長期致力于柑橘細(xì)胞工程與遺傳改良研究，創(chuàng)制了大量多倍體新種質(zhì)和新品種，該研究也為解決柑橘多倍體刺粗且長的難題提供了新思路。值得一提的是，柑橘不僅有枝刺這種物理防御器官，還具有分泌囊結(jié)構(gòu)，分泌和儲藏“化學(xué)防御”物質(zhì)——精油。巧的是，柑橘枝刺基部表皮具有分泌囊，而頂部沒有。利用這一特點，郭文武教授與張飛教授共同指導(dǎo)的博士生任杰關(guān)注到刺基部優(yōu)勢表達(dá)基因，發(fā)掘出蕓香科分泌囊形成的特異順式調(diào)控元件及與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，在分泌囊發(fā)育調(diào)控方面取得了突破（Wang et al., 2024）。

 

　　華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘團(tuán)隊已畢業(yè)博士生任杰（現(xiàn)為耶魯大學(xué)博士后）為該論文第一作者，郭文武教授和張飛教授為該論文共同通訊作者。鄧秀新院士參與指導(dǎo)了該研究，伍小萌教授和解凱東副教授、耶魯大學(xué)Vivian F. Irish教授等參與了該研究。該研究受到了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、國家柑橘產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系等項目資助。

 

　　論文鏈接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2510775122

 

　　【英文摘要】

 

　　A common characteristic of thorns, prickles, and spines is a hardened and sharp tip. This feature complicates cultivation and postharvest processing for many crops, yet the molecular mechanisms governing this specific sclerification process remain unclear. By genome editing screening, we identified a MYB family gene named SHORT and SOFT THORN 1 （SST1） that specifically promotes the development of sclerenchyma cells at Citrus thorn tips. CRISPR-Cas9 editing of SST1 results in the formation of short and soft thorns with significantly reduced secondary wall thickening at the tips, while leaving stem growth unaffected. SST1 directly activates NST1 and SND1, driving a hierarchical transcriptional regulatory network for secondary wall biosynthesis. Moreover, SST1 homologs in various species are specifically expressed in thorns, suggesting a potential conserved role. Our results uncover the molecular basis for hard plant protective structures, and modulation of this pathway could be an effective strategy for optimizing cultivation practices.