中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所作物分子育種技術(shù)和應(yīng)用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)與石家莊博瑞迪生物技術(shù)有限公司領(lǐng)銜的聯(lián)合研究小組，致力于液相生物芯片的研發(fā)。經(jīng)過幾年的努力，開發(fā)出高密度靶向測序-液相芯片技術(shù)體系，在通量、成本和效益上可以完全取代固相芯片，研究成果先后在《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)》、《分子育種（Molecular Breeding）》和《植物通訊（Plant Communications）》雜志發(fā)表。

 

　　據(jù)介紹，與工業(yè)上的集成電路（芯片）相類似，生物芯片就是通過縮微技術(shù)，根據(jù)分子間的特異性相互作用的原理，將不連續(xù)的分析過程集成于硅或玻璃等固相芯片表面，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其他生物成分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。在生物分子檢測和基因型鑒定領(lǐng)域，包含高密度分子標(biāo)記或探針的生物芯片發(fā)揮著巨大作用，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、基因組學(xué)、遺傳學(xué)和育種。過去20年來，高密度生物芯片主要由兩家跨國公司主導(dǎo)，中國市場的生物芯片均依賴這兩家公司進(jìn)行設(shè)計(jì)、制作和檢測，一方面導(dǎo)致中國動(dòng)植物育種所需芯片的定制需求響應(yīng)周期慢、發(fā)貨時(shí)間長、持續(xù)的技術(shù)支持和服務(wù)缺乏、成本高昂；另一方面，生物芯片作為生物育種關(guān)鍵性的分子檢測技術(shù)，從源頭上決定了種業(yè)的科技水平和國家的糧食安全。因此亟待發(fā)展能夠替代固相芯片、更加簡單高效的高密度分子檢測方法和技術(shù)。

 

　　聯(lián)合研究小組首先從前期研發(fā)的玉米55K SNP芯片挑選多態(tài)性高、缺失率低、染色體上分布均勻的20K SNP標(biāo)記，結(jié)合靶向測序基因型檢測（Genotyping by Targeted Sequencing, GBTS）技術(shù)，對(duì)標(biāo)記探針進(jìn)行液相捕獲，完成了1K、5K、10K、20K等一系列液相芯片標(biāo)記的開發(fā)。利用96份來自世界各地的玉米自交系和387份育種項(xiàng)目產(chǎn)生的中間材料對(duì)液相芯片進(jìn)行測試，證實(shí)了芯片檢測的高度重復(fù)性和可靠性（Molecular Breeding 39:37, 2019）。隨后，經(jīng)過技術(shù)優(yōu)化和改進(jìn)，使單個(gè)液相芯片的檢測效率在玉米中增加到40K mSNP、260K SNP、912K 單倍型。根據(jù)應(yīng)用場景對(duì)標(biāo)記密度的需求，通過控制測序深度就可以從同一標(biāo)記集獲得從1K 到40K mSNP任意位點(diǎn)（擴(kuò)增子）以及由此衍生的不同數(shù)量的SNP標(biāo)記和單倍型（Plant Communications 2: 100230, 2021）。

　　圖1 靶向測序-液相芯片技術(shù)流程及其改進(jìn)和優(yōu)化

 

　　靶向測序-液相芯片技術(shù)由兩個(gè)獨(dú)特但又相互交叉的技術(shù)體系組成：GenoPlexs和GenoBaits，都是在液相條件下對(duì)靶向片段進(jìn)行擴(kuò)增、捕獲和檢測。GenoPlexs涉及兩輪靶向位點(diǎn)的定點(diǎn)擴(kuò)增，目前，該技術(shù)已可以實(shí)現(xiàn)單管高達(dá)2000對(duì)以上特定引物的混合擴(kuò)增。GenoBaits的工作原理是基于目標(biāo)探針與靶向序列互補(bǔ)結(jié)合進(jìn)行定點(diǎn)捕獲，對(duì)捕獲的靶點(diǎn)序列進(jìn)行洗脫、靶點(diǎn)擴(kuò)增、建庫和測序，最終獲得目標(biāo)SNP的基因型，在經(jīng)濟(jì)有效的條件下，所能檢測的靶向位點(diǎn)及其標(biāo)記數(shù)目在玉米中可以達(dá)到40K mSNP、260K SNP 和912K單倍型的水平，在檢測密度和通量上等同于高密度固相芯片。

 

　　與常規(guī)測序檢測和固相芯片分析相比，靶向測序-液相芯片技術(shù)具有平臺(tái)廣適性，不需要借助于特定的昂貴設(shè)備，可以采用各種可供利用的測序平臺(tái)。標(biāo)記定制時(shí)沒有起始樣本量和標(biāo)記數(shù)量的限制，測序與標(biāo)記基因型檢測可在同一管內(nèi)完成；使用時(shí)沒有單次檢測樣本量限制；可隨時(shí)向體系中加入新的引物或?qū)σ延幸镞M(jìn)行調(diào)整；根據(jù)同一套高密度標(biāo)記，可以通過調(diào)整測序深度來獲得不同數(shù)量的標(biāo)記。所有檢測試劑均實(shí)現(xiàn)了本地化，從而大大降低了試劑成本，同時(shí)利用現(xiàn)有的測序設(shè)備降低了檢測設(shè)備的維護(hù)、管理和運(yùn)營有關(guān)的成本。液相芯片技術(shù)具有高度重復(fù)性和可靠性，便于將不同時(shí)間、地點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)所獲得的信息進(jìn)行累加、比較和綜合。與固相芯片、全基因組重測序和隨機(jī)的簡化基因組測序等技術(shù)相比，對(duì)于平臺(tái)和支撐系統(tǒng)的要求很低，不需要借助于額外的檢測技術(shù)或高度專業(yè)化的生物信息團(tuán)隊(duì)（中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 53:2983-3004, 2020）。

 

　　聯(lián)合研究小組還探討了如何在液相芯片技術(shù)的支撐下，通過分子植物育種，助推作為國家種業(yè)戰(zhàn)略的海南省南繁種業(yè)的轉(zhuǎn)型升級(jí)（中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 54, 2021）。液相芯片技術(shù)與現(xiàn)代育種技術(shù)相融合，將助推南繁種業(yè)從單一的繁殖加代向資源引進(jìn)和評(píng)價(jià)、育種選擇、純度檢測、種質(zhì)交流和產(chǎn)權(quán)保護(hù)等在內(nèi)的全產(chǎn)業(yè)鏈模式轉(zhuǎn)變，實(shí)現(xiàn)從海南冬繁到周年育種的轉(zhuǎn)變，將海南的南繁地理和生態(tài)優(yōu)勢轉(zhuǎn)化為南繁與育種相整合的全產(chǎn)業(yè)鏈優(yōu)勢，加快育種進(jìn)展、提高育種效率，促進(jìn)種業(yè)發(fā)展。要實(shí)現(xiàn)“海南育種，全國測試”，需要構(gòu)建包括液相芯片技術(shù)支撐下的高效育種設(shè)施、快速育種、轉(zhuǎn)基因和基因編輯技術(shù)、雙單倍體育種技術(shù)、全基因組選擇等在內(nèi)的綜合育種體系。

 

　　靶向測序-液相芯片技術(shù)可取代現(xiàn)有的固相芯片技術(shù)和其他中高密度的分子檢測系統(tǒng)，廣泛應(yīng)用于生物進(jìn)化、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位克隆、標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析、后裔鑒定、基因漸滲、基因累加、品種權(quán)保護(hù)、產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測、轉(zhuǎn)基因成分/基因編輯/伴生生物檢測等領(lǐng)域。聯(lián)合研究小組以玉米為例，采用867份來自世界各地不同類型的玉米自交系，分別利用不同標(biāo)記類型進(jìn)行多樣性、群體結(jié)構(gòu)、連鎖非平衡衰減和全基因組關(guān)聯(lián)分析。研究證實(shí)，利用mSNP及其單倍型替代固相芯片中的單一SNP標(biāo)記能夠獲得額外的檢測效率（Plant Communications 2: 100230, 2021）?；诎邢驕y序和mSNP的液相芯片技術(shù)具有廣泛的物種適應(yīng)性，可以用于所有動(dòng)植物和微生物的分子檢測。目前已經(jīng)在13種主要農(nóng)作物、蔬菜以及部分動(dòng)物和微生物中開發(fā)了基于GBTS的液相芯片50余套，并已在上述領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

　　圖2 高分辨率多聚SNP （mSNP） 液相芯片檢測技術(shù)體系及其應(yīng)用

 

　　參與該聯(lián)合研究的團(tuán)隊(duì)還包括佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院、上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、新疆農(nóng)墾科學(xué)院、河北省農(nóng)林科學(xué)院、江漢大學(xué)和國際玉米小麥改良中心。