12月16日，北京市農(nóng)林科學院玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室基因組編輯團隊在Frontiers系列新期刊Frontiers in Genome Editing上發(fā)表題為“Genome engineering in plant using an efficient CRISPR-xCas9 toolset with an expanded PAM compatibility”的研究論文。該研究建立了基于SpCas9變體xCas9的基因敲除系統(tǒng)和胞嘧啶堿基編輯系統(tǒng)，成功將基因編輯的前間區(qū)序列鄰近基序（PAM）范圍拓展至GAD（D=A,T,G）和松弛型的NG，為在更廣泛的基因組范圍內(nèi)選擇基因編輯靶點提供了可能。
拓展CRISPR/Cas9核酸酶PAM范圍是使其在植物中被更廣泛應用的關鍵。2018年，David Liu團隊在Nature上報道了一種能識別NG，GAA和GATPAM的SpCas9變體（xCas9）。2019年，多個實驗室相繼報道了xCas9在植物上的表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)其能夠拓展基因組編輯范圍至NGPAM位點，但對于GAA和GAT PAM 位點，在水稻T0苗中僅有一個GATPAM位點實現(xiàn)編輯被報道。而目前具有更大PAM范圍的另一SpCas9變體（SpCas9-NG）在植物中和動物中都不識別GAA和GATPAM。因此，為了將基因組編輯范圍拓展至GAA和GATPAM位點，植物中的xCas9基因編輯系統(tǒng)亟待優(yōu)化和提高。
本研究通過使用tRNA連接強化sgRNA，形成高效的tRNA-esgRNA系統(tǒng)，開發(fā)出了基于xCas9的基因編輯系統(tǒng) （CRISPR-xCas9），首次發(fā)現(xiàn)CRISPR-xCas9在植物中能夠有效的切割GAAPAM位點和多個GATPAM位點，同時發(fā)現(xiàn)其還能夠有效切割多個GAGPAM位點（動物中尚無報道），并且仍然保持編輯松弛型的NGPAM位點的能力。該研究進一步利用相似的載體結(jié)構(gòu)開發(fā)了基于xCas9的胞嘧啶堿基編輯系統(tǒng) （xCas9n-CBE），發(fā)現(xiàn)xCas9n-CBE在植物中可以對基因組上的以GA和松弛型的NG為PAM的靶點進行有效堿基編輯。本團隊曾在2019年成功開發(fā)出基于xCas9的另一款新型堿基編輯器（xCas9-pBE），本研究開發(fā)的xCas9n-CBE與之相比，不但能夠拓展編輯xCas9-pBE不能編輯的NGCPAM位點，而且表現(xiàn)出更高的平均堿基編輯效率和更寬的編輯窗口。除上述兩款新型堿基編輯器外，本團隊還在2019年開發(fā)出基于SpCas9及其變體VQR、以及SaCas9變體SaKKH的多款新型堿基編輯器，實現(xiàn)了對PAM 為NAG、NGA、NNMRRT及NNKRGT靶點的C至T堿基替換。綜合應用這些具有不同特點的堿基編輯器，可以更大范圍地拓展作物基因組上基因組編輯的可靶向區(qū)域，具有很大的應用潛力。
玉米中心張成偉博士為本文第一作者，楊進孝為本文通訊作者。本研究得到北京學者（BSP041）項目和北京市自然科學基金（6204041）資助。玉米基因組編輯團隊是2017年組建成立的，目前主要聚焦于堿基編輯、精確替換、組學編輯及其在玉米和水稻等作物中的高效應用。這是該團隊自成立以來在國際學術(shù)期刊上發(fā)表的第8篇高水平研究論文。
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