近期，江南大學(xué)生物工程學(xué)院陳獻(xiàn)忠教授團(tuán)隊(duì)在熊蜂生假絲酵基因編輯技術(shù)方面取得重要進(jìn)展，研究成果“A CRISPR–Cas9 system mediated genetic disruption and multi-fragment assembly inStarmerella bombicola”正式發(fā)表于ACS Synthetic Biology（IF=5.11, 2022） （DOI: 10.1021/acssynbio.1c00582）。

 

　　槐糖脂作為一種生物表面活性劑，因其具有乳化性、增溶性、抑菌性及生物可降解表面活性等特性，近年來展現(xiàn)出相當(dāng)廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。熊蜂生假絲酵母（Starmerella bombicola）作為槐糖脂生產(chǎn)菌株之一，可以在以油酸和葡萄糖為共同碳源的條件下生產(chǎn)槐糖脂。然而，該菌株作為一種非常規(guī)假絲酵母，其遺傳背景并不清晰，且表達(dá)系統(tǒng)不夠完善，同時(shí)常規(guī)的基因改造手段效率低。因此在很大程度上限制了該菌株的代謝工程改造。

 

　　陳獻(xiàn)忠教授團(tuán)隊(duì)針對(duì)上述問題，以酵母增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（yEGFP）為報(bào)告基因，篩選熊蜂生假絲酵母啟動(dòng)子表達(dá)元件，獲得了系列轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度不同的啟動(dòng)子。在此基礎(chǔ)上，將來源于釀膿桿菌的Cas9基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，在強(qiáng)啟動(dòng)子PTEF1驅(qū)動(dòng)下構(gòu)建了整合表達(dá)型CRISPR-Cas9編輯系統(tǒng)。通過設(shè)計(jì)并結(jié)合不同強(qiáng)度啟動(dòng)子及sgRNA表達(dá)元件對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，最終在大大提高陽性轉(zhuǎn)化子數(shù)量的同時(shí)，使得單基因及雙基因編輯效率達(dá)到100%，并實(shí)現(xiàn)了三基因的同時(shí)編輯（16.5%）。該團(tuán)隊(duì)也對(duì)瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)表達(dá)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)在單基因編輯時(shí)也可以達(dá)到100%的編輯效率。此外，在CRSIPR-Cas9系統(tǒng)的介導(dǎo)下，通過體內(nèi)一步多片段組裝技術(shù)，在敲除內(nèi)酯化酶SBLE和過氧化物酶體膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PXA1基因的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用強(qiáng)組成型啟動(dòng)子PTEF1及PENO，上調(diào)槐糖脂合成關(guān)鍵基因CYP52M1及CPR的表達(dá)，最終得到了單一生產(chǎn)酸型槐糖脂高產(chǎn)重組菌株，其酸型槐糖脂的產(chǎn)量可以達(dá)到99.5 g/L，相比于野生型菌株提高了5.5倍。本研究為該菌株在代謝工程改造方面提供了高效的編輯工具，同時(shí)也為槐糖脂的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

 

　　陳獻(xiàn)忠教授為上述系列論文的通訊作者，我校2021級(jí)博士生石依博為第一作者。上述研究得到了國防科技項(xiàng)目（18-163-12-ZT-003-014）和江蘇省自然科學(xué)基金（BK20171138）等項(xiàng)目資助

 

　　近年來陳獻(xiàn)忠教授團(tuán)隊(duì)以具有重要工業(yè)應(yīng)用潛力的非常規(guī)酵母為底盤細(xì)胞，開發(fā)了系列高效的基因編輯技術(shù)和代謝調(diào)控方法（Biotechnology and Bioengineering, 2020；Microbiology Spectrum，2022），并通過系統(tǒng)代謝工程構(gòu)建了高效生產(chǎn)萜類天然產(chǎn)物的酵母細(xì)胞工廠（Biotechnology for Biofuels and Bioproducts, 2022）。