背景介紹
花生是常見(jiàn)的食品過(guò)敏原之一，具有發(fā)病率高、過(guò)敏反應(yīng)嚴(yán)重和對(duì)過(guò)敏個(gè)體產(chǎn)生終身持續(xù)影響等特點(diǎn)。研究表明，發(fā)酵可降低花生的致敏性，還可提高花生的口感、消化率和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；此外發(fā)酵菌及其代謝產(chǎn)物可調(diào)節(jié)Th1/Th2反應(yīng)的平衡，增強(qiáng)上皮屏障功能，有助于減緩過(guò)敏水平甚至預(yù)防過(guò)敏。
納豆芽孢桿菌是一種安全、耐酸、耐熱的益生菌，具有抗菌、抗癌、溶栓等多種功能活性。納豆芽孢桿菌還具有很強(qiáng)的產(chǎn)酶能力，可以有效降解蛋白質(zhì)。高壓滅菌常用于微生物發(fā)酵和降低花生致敏性。本研究利用納豆芽孢桿菌聯(lián)合高壓滅菌輔助發(fā)酵工藝降低了生花生漿的致敏性，使用ELISA檢測(cè)了發(fā)酵對(duì)花生過(guò)敏原的影響并研究了發(fā)酵過(guò)程中花生蛋白結(jié)構(gòu)的變化，以期為花生蛋白的結(jié)構(gòu)特征和致敏性提供新的信息，為開(kāi)發(fā)低過(guò)敏花生發(fā)酵產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。
研究方法
將脫紅衣花生與水以1:9（m/v）的比例混合、磨漿后制成花生漿（RPP），將RPP在121 ℃下高壓滅菌20 min獲得滅菌花生漿（APP），后接種9.8×105 CFU/mL的納豆芽孢桿菌并在37 ℃下培養(yǎng)，以不同時(shí)間（12、24、36、48、60 h）發(fā)酵后收集樣品，并標(biāo)記為FAPP-B-12、FAPP-B-24、FAPP-B-36、FAPP-B-48、FAPP-B-60。提取各組蛋白，并以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。使用SDS-PAGE測(cè)定各組蛋白的分子量，通過(guò)間接ELISA確定IgE結(jié)合能力。使用掃描電鏡觀(guān)察花生蛋白的微觀(guān)結(jié)構(gòu)，結(jié)合圓二色譜評(píng)估蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化并利用紫外光譜儀測(cè)定不同樣品的紫外吸收光譜，通過(guò)ANS法確定每個(gè)樣品的表面疏水性，并用SH-DNTB測(cè)定游離巰基的含量，最后使用高靈敏度納米顆粒分析儀測(cè)定花生蛋白粒徑。
結(jié)果與分析
結(jié)果表明，高壓滅菌和發(fā)酵會(huì)導(dǎo)致高分子量的花生蛋白逐漸降解（圖1）。間接ELISA的結(jié)果表明在單獨(dú)高壓滅菌后，RPP的過(guò)敏原性降低了66.6%，隨著發(fā)酵進(jìn)一步降低（圖2）。使用掃描電鏡觀(guān)察花生蛋白的微觀(guān)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)FAPP-Bs具有更小的聚集體和更松散的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖3），這可能是由于納豆芽孢桿菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白酶催化花生蛋白去折疊和降解所致。圓二色譜（圖4）和紫外吸收光譜（圖5）的結(jié)果表明，高壓滅菌和發(fā)酵誘導(dǎo)了花生蛋白的水解、去折疊和構(gòu)象變化以及α-螺旋的減少，這些變化均會(huì)顯著影響表位的形成。蛋白質(zhì)疏水性的改變通常反映其三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)改變，使用ANS熒光探針和SH-DNTB分別測(cè)定了不同處理后花生蛋白表面疏水性和游離巰基的變化，結(jié)果表明當(dāng)發(fā)酵48小時(shí)后，花生蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)受到的影響最大；高溫滅菌會(huì)引起蛋白質(zhì)聚集，可能導(dǎo)致游離巰基在分子內(nèi)部或分子間形成二硫鍵，發(fā)酵過(guò)程中游離巰基含量的進(jìn)一步降低可能與生成的蛋白或過(guò)氧化物導(dǎo)致游離巰基隱藏或氧化有關(guān)。粒徑分析表明，由于高壓滅菌引起的蛋白質(zhì)聚集，APP的粒徑大部分分布在550 nm至100 nm之間。
圖1 從RPP、APP和FAPP-Bs中提取的蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量
（M，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子量；1-7依次代表從RPP，APP，F(xiàn)APP-B-12，F(xiàn)APP-B-24，F(xiàn)APP-B-36，F(xiàn)APP-B-48，F(xiàn)APP-B-60提取的蛋白質(zhì)）
圖2 RPP、APP和FAPP-Bs蛋白的致敏性
圖3 凍干產(chǎn)物外觀(guān)（第一排）及蛋白質(zhì)掃描電鏡（第二排和第三排放大倍數(shù)分別為200和4000），1-7依次代表RPP、APP、FAPP-B-12、FAPP-B-24、FAPP-B-36、FAPP-B-48、FAPP-B-60的凍干產(chǎn)物及其蛋白質(zhì)
圖4 （A）RPP，APP，F(xiàn)APP-Bs的圓二色譜；（B）根據(jù)其比例計(jì)算出相應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)
圖5 從RPP、APP和FAPP-Bs中提取的蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。A，紫外吸收光譜；B，熒光發(fā)射光譜；C，游離巰基（SH）含量
結(jié)論
結(jié)果表明，高壓滅菌和納豆芽孢桿菌發(fā)酵可降解花生蛋白、改變蛋白質(zhì)構(gòu)象并減少α-螺旋，引起花生蛋白質(zhì)粒徑的變化，從而導(dǎo)致生花生IgE結(jié)合特性顯著降低。因此利用納豆芽孢桿菌聯(lián)合高壓滅菌輔助發(fā)酵是生產(chǎn)低致敏性、高品質(zhì)花生制品的有效工藝手段。
行業(yè)：
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