近期，江南大學(xué)生物工程學(xué)院周哲敏教授團(tuán)隊(duì)在基于生物傳感器的酶高通量篩選平臺(tái)開發(fā)方面取得重要進(jìn)展，研究成果“Construction and Application of a High-Throughput In Vivo Screening Platform for the Evolution of Nitrile metabolism-Related Enzymes based on a Desensitized Repressive Biosensor”正式發(fā)表于ACS Synthetic Biology （IF=5.11）（ https://doi.org/10.1021/acssynbio.1c00642）。

 

　　腈類化合物是合成高附加值酰胺類和羧酸類化合物的重要工業(yè)原料，腈代謝相關(guān)酶（腈水解酶、酰胺酶、腈水合酶等）是驅(qū)動(dòng)這一轉(zhuǎn)化過程的理想生物催化劑。然而，這些酶的高活性改造因?yàn)槿狈Ω咄亢Y選方法而受到制約。生物傳感器能夠?qū)⒚富钆c細(xì)胞表型進(jìn)行偶聯(lián)，用于酶的體內(nèi)超高通量篩選。煙酸是腈水解酶、酰胺酶和腈水合酶催化煙腈的終產(chǎn)物，因此，開發(fā)煙酸生物傳感器可搭建以上三種酶的通用篩選平臺(tái)。

 

　　研究者首先利用枯草芽孢桿菌來源的煙酸抑制型轉(zhuǎn)錄因子NadR及其靶標(biāo)啟動(dòng)子，在大腸桿菌中構(gòu)建煙酸生物傳感器NAsensor。進(jìn)一步，通過易錯(cuò)PCR的方式對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NadR進(jìn)行改造，成功篩選得到在0-50mM煙酸濃度范圍內(nèi)具備良好梯度信號(hào)輸出的NAsensor。利用同源建模、分子對(duì)接及動(dòng)力學(xué)模擬，他們發(fā)現(xiàn)NadR中引入的隨機(jī)突變降低了與配體煙酸的親和力，且配體結(jié)合自由能的改變與NadR靈敏度的降低強(qiáng)相關(guān)。另外，分子動(dòng)力學(xué)分析顯示，NadR突變體DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的柔性明顯降低，暗示其結(jié)合DNA能力下降，有利于檢測(cè)梯度的建立。

 

　　基于改造后的NAsensor，研究者設(shè)計(jì)和構(gòu)建了腈水解酶和酰胺酶的體內(nèi)高通量篩選平臺(tái)。利用CAST策略構(gòu)建腈水解酶和酰胺酶的隨機(jī)組合突變體庫，篩選獲得高活性突變體。在此基礎(chǔ)上，研究者又拓展NAsensor用于篩選腈水合酶，在NAsensor中引入了煙酰胺轉(zhuǎn)化模塊，使得腈水合酶催化煙腈的產(chǎn)物煙酰胺能夠被迅速轉(zhuǎn)化為煙酸，進(jìn)而被NAsensor檢測(cè)。利用拓展的NAsensor，實(shí)現(xiàn)了熱穩(wěn)定腈水合酶的高活性進(jìn)化。值得注意的是，通過該平臺(tái)篩選到的高活性突變體，不僅僅催化煙腈/煙酰胺的活性大幅提升，對(duì)結(jié)構(gòu)類似的其他芳香族底物的活性同樣提升明顯。本研究成果說明基于抑制型的生物轉(zhuǎn)錄因子更適合梯度篩選的生物傳感器構(gòu)建，同時(shí)也將大力促進(jìn)腈類化合物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的生物制備。

 

　　江南大學(xué)生物工程學(xué)院博士后韓來闖為本文第一作者，周哲敏教授為通訊作者。該研究得到包括江蘇省自然科學(xué)基金（BK20210470）、中國博士后科學(xué)基金（2021M701461）等項(xiàng)目資助。