枇杷為薔薇科常綠植物，是起源于我國的名果異樹，北宋藥學(xué)家蘇頌在《本草圖經(jīng)》中用“木高丈余，肥枝長葉……熟時色如黃杏，…，核大如茅栗，黃褐色。四月采葉，暴干用”來描述枇杷作為藥、果兩用植物的特性。根據(jù)《史記·司馬相如傳》記載，早在2000多年前的西漢時代，我們的先輩就開始生產(chǎn)甜美多汁的枇杷果實(shí)。此外，枇杷葉片長久以來作為傳統(tǒng)藥物被中國及周邊國家民眾用于治療咳嗽、慢性支氣管炎、炎癥等多種疾病。藥理研究表明，枇杷中的一些三萜酸等天然小分子，如熊果酸和科羅索酸，具有抗癌和降血糖等多種生物活性，也是其入藥的重要代謝物基礎(chǔ)。然而，枇杷何以富含三萜酸等活性小分子的分子進(jìn)化機(jī)制一直不為公眾所知。

 

　　近日，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林順權(quán)研究組聯(lián)合上海交大劉振華研究組及深圳華大基因、莆田學(xué)院等單位合作在《美國科學(xué)院院報》（PNAS）上發(fā)表題為“Polyploidy underlies co-option and diversification of biosynthetic triterpene pathways in the apple tribe”的研究論文。（地址https://doi.org/10.1073/pnas.2101767118）該論文綜合運(yùn)用基因組、代謝組、轉(zhuǎn)錄組與合成生物學(xué)等研究手段，系統(tǒng)分析了枇杷中主要三萜酸小分子在蘋果亞科全基因組復(fù)制前后的合成通路、表達(dá)模式以及進(jìn)化路線。研究表明，蘋果族植物大約在13至27 百萬年前發(fā)生了一次全基因組復(fù)制（WGD）事件。與相近物種相比，枇杷基因組在WGD之后保留下了2套完整的烏蘇烷型三萜酸合成通路基因。同時，這兩套基因在枇杷葉等組織中表現(xiàn)出更緊密的共表達(dá)關(guān)系。經(jīng)歷全基因組復(fù)制、代謝通路的共選擇和代謝基因緊密高表達(dá)后，枇杷葉相比其他薔薇科植物獲得了更強(qiáng)的熊果酸和科羅索酸等主要三萜酸的富集能力。該研究從基因組水平上為枇杷作為藥用植物提供了遺傳學(xué)與基因組學(xué)證據(jù)。

　　枇杷富含三萜酸的分子進(jìn)化基礎(chǔ)

 

　　該聯(lián)合團(tuán)隊(duì)首先結(jié)合PacBio、Hi-C（華大自主研發(fā)DNBSEQ平臺） 和 Illumina測序組裝了枇杷主栽品種‘解放鐘’染色體水平的高質(zhì)量基因組。同時為方便開展比較基因組學(xué)分析，團(tuán)隊(duì)還率先組裝了蘋果族近緣植物美吐根（Gillenia trifoliata）染色體水平的高質(zhì)量基因組。多物種的單拷貝基因進(jìn)化分析表明，蘋果族植物（含枇杷、蘋果和梨在內(nèi)）在大約13.5至27.1 百萬年前與美吐根祖先發(fā)生了物種分化。染色體共線性分析發(fā)現(xiàn)，美吐根/桃與枇杷/蘋果的染色體共線性塊存在1:2的關(guān)系，預(yù)示枇杷/蘋果所在分支在演化過程中發(fā)生了全基因組復(fù)制事件（WGD）。

　　比較基因組分析證實(shí)蘋果族在13.5至27.1百萬年前發(fā)生了全基因組復(fù)制

 

　　為判斷枇杷與近緣物種葉片三萜酸積累能力的差異，研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)分析了桃-美吐根-枇杷-蘋果不同發(fā)育階段葉片中的三萜酸組分和總量差異。結(jié)果表明，分析的四個物種均主要積累烏蘇烷型和齊墩果烷型三萜酸，有意思的是枇杷成熟葉片的三萜酸（特別是熊果酸和科羅索酸為主的烏蘇烷型三萜酸）積累總量是桃-美吐根-蘋果的近10倍。更細(xì)致的發(fā)育階段代謝分析表明，枇杷葉在葉片發(fā)育中期即開始大量積累熊果酸，而在葉片老熟階段才開始大量合成科羅索酸。為鑒定在葉片等組織中合成枇杷烏蘇烷型三萜酸的主要催化酶基因，團(tuán)隊(duì)首先以不同類型三萜酸合成第一步關(guān)鍵催化步驟酶基因家族鑒定為切入點(diǎn)，結(jié)合組織轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)2個高表達(dá)的氧化鯊烯合成酶基因EjOSC1/2（其同源基因編碼蛋白主要合成α香樹精，烏蘇烷型三萜酸的前體）。同時圍繞這兩個OSC基因?qū)D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行共表達(dá)分析，挖掘到兩個三萜酸修飾基因，CYP716A和CYP716C。煙草瞬時表達(dá)表明，枇杷中含有至少兩條完整的烏蘇烷型三萜酸合成通路：EjOSC1-EjCYP716A1-EjCYP716C1和EjOSC2-EjCYP716A2-EjCYP716C2。

　　枇杷三萜酸合成基因鑒定與代謝通路推定

 

　　通過對桃、美吐根（WGD事件之前）以及蘋果、枇杷（WGD事件之后）在基因組、代謝組和轉(zhuǎn)錄組等多組學(xué)的綜合研究，研究人員發(fā)現(xiàn)，合成烏蘇烷類型的三萜酸OSC-CYP716A-CYP716C在WGD事件之前就已經(jīng)存在，全基因組復(fù)制后，該通路得以在枇杷中完整復(fù)制和保留。有意思的是，OSC-CYP716A-CYP716C通路基因在枇杷中的共表達(dá)相關(guān)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于美土根，表明全基因組復(fù)制后，代謝通路變得更高效。

 

　　綜上，該研究揭示了枇杷葉在漫長人類歷史發(fā)展過程中被選作藥材的一種可能的分子進(jìn)化機(jī)制。同時，也為利用合成生物學(xué)開發(fā)高價值的天然小分子以及枇杷分子育種提供了基因組基礎(chǔ)，還為薔薇科的比較基因組學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)等研究提供了高質(zhì)量的基因組支撐。

 

　　以上研究工作由林順權(quán)課題組聯(lián)合深圳華大基因、莆田學(xué)院和上海交通大學(xué)等多家單位協(xié)作完成。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蘇文炳博士（現(xiàn)福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所副研究員）、深圳華大基因靜一，林授鍇（莆田學(xué)院）  、岳震（華大）和楊向暉（華農(nóng)）為共同第一作者；華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林順權(quán)教授和上海交通大學(xué)劉振華副教授為共同通訊作者。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)夏瑞研究組以及英國諾丁漢大學(xué)LeviYant等參與了本研究。研究的開展得到了農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201003073）、福建省高校服務(wù)海西建設(shè)重點(diǎn)項(xiàng)目（2008HX02）、國家自然科學(xué)基金（31901973）、上海市浦江人才計劃、國家重點(diǎn)研發(fā)（2019YFD1000200）等項(xiàng)目的共同資助。、