大豆是我國(guó)重要糧油飼兼用作物，提升產(chǎn)量和品質(zhì)是我國(guó)大豆產(chǎn)業(yè)面臨的重大挑戰(zhàn)。大豆是高蛋白作物，對(duì)氮素的需求高。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，大豆演化出了共生固氮這個(gè)重要的優(yōu)異性狀，即在土壤氮素不足的情況下，與根瘤菌互作共生形成根瘤，將空氣中的氮?dú)膺€原為氨，為植物提供充足的氮素。據(jù)研究報(bào)道，共生固氮可為植物總生物量提供近70 %的氮素，為其籽粒提供超過(guò)80%的氮素。因此，提高共生固氮效率是提升大豆產(chǎn)量和品質(zhì)的重要途徑。適宜的根瘤數(shù)量是決定共生固氮效率的首要因子。在過(guò)去的近三十年中，豆科植物結(jié)瘤的分子遺傳調(diào)控機(jī)制研究取得了重要進(jìn)展，但主要集中在大量必需養(yǎng)分（如氮）變化下結(jié)瘤的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制方面。全球氣候變暖加劇了耕地鹽堿化，導(dǎo)致土壤微量必需養(yǎng)分（如鐵等）難以被吸收，導(dǎo)致作物共生固氮能力下降，產(chǎn)量品質(zhì)降低。因此，明確微量必需養(yǎng)分在大豆等豆科作物結(jié)瘤中的作用，解析其分子調(diào)控機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步提高大豆等作物的共生固氮效率及產(chǎn)量品質(zhì)具有重要意義。

 

　　鐵是植物和微生物生長(zhǎng)發(fā)育所必需微量養(yǎng)分，參與呼吸、光合等多個(gè)生物過(guò)程。鐵也是固氮酶和豆血紅蛋白重要組成成分，是豆科植物成熟根瘤的固氮活力一個(gè)決定因子。然而，鐵在大豆等根瘤形成中的作用以及大豆感知環(huán)境鐵并將鐵信號(hào)整合到結(jié)瘤信號(hào)中的分子機(jī)制尚不清楚。

 

　　為了研究鐵對(duì)大豆結(jié)瘤的影響，研究團(tuán)隊(duì)首先建立了一個(gè)水培體系，系統(tǒng)評(píng)價(jià)了不同鐵濃度對(duì)根瘤菌侵染（侵染線和根瘤原基）和根瘤數(shù)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使在充足光照和氮匱缺條件下，沒(méi)有鐵大豆-根瘤菌共生結(jié)瘤過(guò)程完全被抑制，說(shuō)明鐵是大豆結(jié)瘤一個(gè)重要驅(qū)動(dòng)力。此外，明確了大豆共生結(jié)瘤的最適宜鐵濃度大約是40  µM，鐵低于該劑量造成養(yǎng)分不足，而高于該水平造成氧化脅迫均抑制早期侵染事件和根瘤的形成。進(jìn)一步分子和遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，鐵是通過(guò)影響大豆共生結(jié)瘤上游轉(zhuǎn)錄因子GmNSP1a蛋白的穩(wěn)定和轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而調(diào)控核心基因GmNINs的表達(dá)水平來(lái)發(fā)揮作用。

 

　　由于GmNSP1a不具備識(shí)別和結(jié)合鐵的結(jié)構(gòu)域，研究團(tuán)隊(duì)推測(cè)GmNSP1a蛋白可能接受到一個(gè)鐵響應(yīng)蛋白傳遞來(lái)的信號(hào)。通過(guò)酵母雙雜交篩選，他們篩選到一個(gè)與鐵相關(guān)的GmNSP1a互作蛋白。該蛋白N端含有結(jié)合鐵的Haemerythrin（HHE）結(jié)構(gòu)域、C端含有RING zinc-finger 結(jié)構(gòu)域的蛋白，是擬南芥鐵受體BTS的同源蛋白，因此命名為GmBTSa。 通過(guò)基因家族分析發(fā)現(xiàn)大豆4個(gè)BTS同源蛋白中，GmBTSa和GmBTSb同源性最高，主要在根瘤中高表達(dá)。蛋白互作實(shí)驗(yàn)證明GmNSP1a能夠與GmBTSa和GmBTSb蛋白C端的RING zinc-finger結(jié)構(gòu)域相互作用?；蚬δ苎芯堪l(fā)現(xiàn)，GmBTSa和GmBTSb的轉(zhuǎn)錄和翻譯均受到根瘤菌的誘導(dǎo)，并協(xié)同正向調(diào)控大豆結(jié)瘤。隨后發(fā)現(xiàn)，GmBTSa蛋白具有結(jié)合鐵離子能力并在結(jié)合鐵后變得更加穩(wěn)定，正向調(diào)控低鐵信號(hào)和鐵吸收，Gmbtsa btsb雙突變體幾乎完全喪失了低鐵抑制結(jié)瘤的效應(yīng)，證明GmBTSa/GmBTSb作為鐵受體介導(dǎo)大豆在低鐵下的結(jié)瘤過(guò)程。進(jìn)一步生化實(shí)驗(yàn)證明，GmBTSa/GmBTSb與GmNSP1a結(jié)合并促進(jìn)其蛋白穩(wěn)定性和對(duì)GmNIN基因轉(zhuǎn)錄活性。由此可見，鐵受體GmBTSa/GmBTSb在感受鐵信號(hào)后，進(jìn)一步調(diào)控GmNSP1a蛋白的轉(zhuǎn)錄活性影響大豆結(jié)瘤對(duì)環(huán)境鐵的響應(yīng)。

 

　　進(jìn)而，研究團(tuán)隊(duì)證明了GmBTSa是一個(gè)E3泛素連接酶，但是與擬南芥同源蛋白BTS多泛素化修飾并降解底物調(diào)控植物對(duì)低鐵響應(yīng)不同，大豆的GmBTSa是通過(guò)特異地單泛素化修飾GmNSP1a促進(jìn)其蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性來(lái)促進(jìn)結(jié)瘤。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)IP-MS技術(shù)鑒定了GmNSP1a上被GmBTSa單泛素化的賴氨酸，并發(fā)現(xiàn)將這些賴氨酸突變后的GmNSP1a（GmNSP1a5KR）不再被GmBTSa單泛素化修飾，蛋白的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性也顯著下降，更重要的是突變蛋白GmNSP1a5KR不能恢復(fù)Gmnsp1a突變體的結(jié)瘤表型，證明單泛素化修飾對(duì)GmNSP1a促進(jìn)結(jié)瘤的功能是不可或缺的。NSP1是豆科植物結(jié)瘤信號(hào)中的一個(gè)共有的重要信號(hào)組分。最后，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)生物信息學(xué)分析和遺傳與生化實(shí)驗(yàn)證明，BTS通過(guò)單泛素化修飾NSP1并促進(jìn)結(jié)瘤的分子機(jī)制在豆科植物中是保守的。

 

　　基于以上實(shí)驗(yàn)，研究團(tuán)隊(duì)提出了如下的模型：在鐵充足的條件下，BTS在轉(zhuǎn)錄和翻譯中，水都被根瘤菌誘導(dǎo)，在結(jié)合并感受鐵后蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng)，通過(guò)單泛素化修飾NSP1促進(jìn)其蛋白的穩(wěn)定和轉(zhuǎn)錄活性，激活共生核心基因NIN的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)根瘤菌侵染和根瘤的形成；而在缺鐵條件下，BTS蛋白變得不穩(wěn)定造成對(duì)NSP1蛋白的單泛素化修飾作用減弱，導(dǎo)致NSP1蛋白的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性下降，從而抑制共生信號(hào)以及結(jié)瘤過(guò)程。

 

　　綜上所述，該研究明確了鐵元素在大豆共生結(jié)瘤過(guò)程中的重要作用，并解析了鐵受體BTS-共生信號(hào)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NSP1構(gòu)成的分子調(diào)控模塊通過(guò)監(jiān)測(cè)外部鐵水平調(diào)控豆科植物結(jié)瘤的分子機(jī)制。這些研究結(jié)果揭示了微量必需營(yíng)養(yǎng)元素鐵驅(qū)動(dòng)的豆科植物結(jié)瘤分子遺傳基礎(chǔ)，不僅為提高大豆等豆科作物在鹽堿環(huán)境下的結(jié)瘤與共生固氮效率，提升作物產(chǎn)量品質(zhì)提供了新思路，還為育種家培育“高效、高抗、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)”作物新品種提供新基因和新種質(zhì)資源。此外，鑒于NSP1也是植物與叢枝桿菌共生信號(hào)的一個(gè)重要組分，BTS-NSP1分子模塊及其作用機(jī)制很可能廣泛存在于植物中并參與鐵介導(dǎo)的植物-微生物共生過(guò)程。

 

　　華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已畢業(yè)博士研究生任仔銀為本文第一作者，王志娟副教授和李霞教授為本文通訊作者。吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所張玲副研究員參與了該項(xiàng)研究工作。該工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)基金和面上基金、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)、吉林科技發(fā)展項(xiàng)目等的資助。

 

　　論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41477-024-01896-5