中國農(nóng)大新聞網(wǎng)訊 近日，植物保護(hù)學(xué)院周濤團(tuán)隊在《科學(xué)進(jìn)展》（Science Advances）雜志上發(fā)表了題為“Maize splicing-mediated mRNA surveillance impeded by sugarcane mosaic virus-coded pathogenic protein NIa-Pro”的研究論文，揭示了玉米剪接因子ZmU2AF65B調(diào)控mRNA監(jiān)測通路及其被病毒蛋白阻遏的機(jī)制。該研究圍繞玉米矮花葉病發(fā)生的分子機(jī)理，以主要病原物甘蔗花葉病毒（SCMV）編碼的致病蛋白——核內(nèi)含體蛋白酶NIa-Pro作為“探測器”，揭示了玉米中剪接因子ZmU2AF65B對mRNA監(jiān)測通路的調(diào)控機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)NIa-Pro通過抑制ZmU2AF65B-ZmUPF3分子模塊的功能進(jìn)而削弱了mRNA監(jiān)測通路，從而有利于病毒侵染。

 

　　轉(zhuǎn)錄后加工是真核生物基因表達(dá)過程中的一個關(guān)鍵步驟。在這一階段，轉(zhuǎn)錄本容易受到細(xì)胞內(nèi)外多種因素的影響，導(dǎo)致RNA發(fā)生異常修飾、剪接錯誤或斷裂等問題。為避免有害多肽的產(chǎn)生，真核細(xì)胞依賴mRNA監(jiān)測通路來識別和降解錯誤加工的mRNA。因此，該通路在調(diào)控基因表達(dá)中起重要作用。先前的研究已經(jīng)基本揭示了mRNA監(jiān)測通路的工作機(jī)理，但對其調(diào)控機(jī)制的理解還很有限。

 

　　mRNA監(jiān)測通路是一個依賴于核糖體翻譯起始的mRNA質(zhì)控過程，其下游主要包括三個分支：無義介導(dǎo)的mRNA衰變（NMD）、停滯介導(dǎo)的mRNA衰變（NGD）和非終止介導(dǎo)的mRNA衰變（NSD）。具體來說，當(dāng)核糖體在第一輪翻譯過程中遇到提前終止密碼子（PTC）或因特定RNA結(jié)構(gòu)而停滯時，會分別激活NMD或NGD。許多病毒產(chǎn)生的RNA中也含有PTC和/或特定的RNA基序，使得它們?nèi)菀壮蔀镹MD和/或NGD的靶標(biāo)。因此，由mRNA監(jiān)測通路介導(dǎo)的病毒RNA降解被認(rèn)為是一種廣譜的抗病毒機(jī)制。此外，異常剪接的轉(zhuǎn)錄本中通常包含PTC或具有長的3'UTR、uORF或特定的RNA結(jié)構(gòu)，這些特征使得它們被mRNA監(jiān)測通路識別和清除。但有意思的是，在一些剪接體功能異常的突變體植物中，mRNA監(jiān)測通路的靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本會出現(xiàn)明顯累積，暗示了剪接因子可能在調(diào)控mRNA監(jiān)測通路中發(fā)揮作用。同時，病原物侵染使得寄主細(xì)胞中剪接體功能異常后，也能觀察到大量具有PTC等特征的可變剪接轉(zhuǎn)錄本的累積。在此種背景下，進(jìn)一步使用病原物效應(yīng)子來探究pre-mRNA剪接過程是否以及如何調(diào)控mRNA監(jiān)測通路將十分有意義。

 

　　前期，該團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)SCMV侵染引起的可變剪接轉(zhuǎn)錄本的變化具有促進(jìn)病毒侵染的作用（Du et al., Plant Physiology, 2020, 184: 1514-1531）。為進(jìn)一步理解SCMV調(diào)控可變剪接的機(jī)制，該研究中利用TurboID鄰近標(biāo)記結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）的方法，篩選了多個與NIa-Pro潛在互作的剪接因子；進(jìn)一步通過可變剪接報告系統(tǒng)、互作驗證及內(nèi)源剪接因子表達(dá)沉默實驗，證實了SCMV編碼的NIa-Pro通過與ZmU2AF65B的互作，進(jìn)而操縱RNA剪接。

 

　　隨后，利用Iso-Seq技術(shù)，該研究發(fā)現(xiàn)Zmu2af65b功能缺失突變體（d2）中mRNA監(jiān)測通路基因的可變剪接發(fā)生紊亂，且靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本累積明顯，初步揭示了ZmU2AF65B通過可變剪接正調(diào)控mRNA監(jiān)測通路。通過與SCMV侵染的玉米中發(fā)生可變剪接變化的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，在SCMV侵染的玉米或d2突變體中，mRNA監(jiān)測途徑的6個主要基因（包括ZmUPF3）的轉(zhuǎn)錄本有類似的可變剪接變化。已有研究表明UPF3通過作用于外顯子連接復(fù)合物（EJC）在mRNA監(jiān)測通路的起始階段發(fā)揮重要作用，并在后續(xù)的NMD分支中作為核心組分；擬南芥中的NMD途徑通過靶向AtUPF3產(chǎn)生的具有長3'-UTR的轉(zhuǎn)錄本來調(diào)節(jié)AtUPF3的mRNA水平，從而保證mRNA監(jiān)測通路的功能不會過強(qiáng)或者太弱（負(fù)反饋循環(huán)）。有意思的是，我們發(fā)現(xiàn)在WT玉米中，ZmUPF3通過“內(nèi)含子保留”而產(chǎn)生具有長3'-UTR的轉(zhuǎn)錄本；但在d2植株中不僅產(chǎn)生更少類型的ZmUPF3可變剪接轉(zhuǎn)錄本，而且不產(chǎn)生具有長3'-UTR的轉(zhuǎn)錄本，從而破壞了ZmUPF3的負(fù)反饋循環(huán)。鑒于上述這些重要發(fā)現(xiàn)，該研究之后聚焦到了ZmUPF3。通過RNA-EMSA和MST等實驗證實了ZmU2AF65B可以直接結(jié)合ZmUPF3的pre-mRNA，且主要與3‘剪接位點(diǎn)附近的尿嘧啶富集串進(jìn)行結(jié)合，而且對尿嘧啶富集程度更高的內(nèi)含子的結(jié)合能力更強(qiáng)，進(jìn)而保證ZmUPF3轉(zhuǎn)錄本的正常可變剪接模式，實現(xiàn)對mRNA監(jiān)測通路的正調(diào)控。

 

　　同時，該研究通過在ZmUPF3表達(dá)沉默植株和Zmu2af65b功能缺失突變體中進(jìn)行侵染性實驗，以及基因功能回補(bǔ)實驗，證實了ZmU2AF65B-ZmUPF3是一個抗病毒分子模塊。此外，通過互作實驗、剪接報告系統(tǒng)、突變體病毒侵染以及回補(bǔ)實驗，證實了SCMV編碼的NIa-Pro通過結(jié)合ZmU2AF65B的RRM結(jié)構(gòu)域，破壞了ZmU2AF65B的RNA剪接調(diào)控功能，從而抑制了由ZmU2AF65B-ZmUPF3分子模塊以及mRNA監(jiān)測通路介導(dǎo)抗病毒作用，最終有利于病毒侵染。

 

　　中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院博士后杜開通（入選我校首批興農(nóng)青年學(xué)者）為第一作者，周濤教授為通訊作者，植物病毒研究室成員博士生彭得智、王培、姜彤博士、陳曦博士和范在豐教授，荷蘭格羅寧根大學(xué)吳季秋博士，華大基因朱亞兵博士和姜三杰博士，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)李向東教授，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)曹志艷教授為本研究的完成做出了重要貢獻(xiàn)。在本文研究和撰寫過程中得到了清華大學(xué)劉玉樂教授、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)董莎萌教授、上海師范大學(xué)喬永利教授、中國農(nóng)科院植保所李方方研究員、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)王書偉博士、張永亮教授和郭海龍教授的大力幫助和寶貴建議；該研究得到了國家自然科學(xué)基金、中國博士后科學(xué)基金會和北京市科學(xué)基金等基金的資助。

 

　　原文鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adn3010