近日江南大學(xué)生物工程學(xué)院周哲敏教授團(tuán)隊(duì)在基因編輯研究方面取得突破，成功構(gòu)建了適用于蛋白質(zhì)體內(nèi)原位進(jìn)化的堿基編輯器。研究成果“Development of a base editor for protein evolution via in situ mutation in vivo”發(fā)表于《Nucleic Acids Research》雜志（JCR一區(qū)，影響因子：16.971）（https://doi.org/10.1093/nar/gkab673）。

 

　　蛋白質(zhì)定向進(jìn)化在生命科學(xué)領(lǐng)域舉足輕重。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)定向進(jìn)化通過(guò)體外突變與高通量篩選相結(jié)合的手段獲得優(yōu)勢(shì)突變體。然而，受限于外源重組表達(dá)技術(shù)以及體外功能檢測(cè)技術(shù)瓶頸，傳統(tǒng)研究手段難以對(duì)膜蛋白、蛋白復(fù)合體及毒性蛋白等進(jìn)行體外進(jìn)化。

 

　　為了解決這一問(wèn)題，周哲敏教授研究團(tuán)隊(duì)獨(dú)辟蹊徑，開發(fā)了基于CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的堿基編輯器實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)體內(nèi)原位進(jìn)化的新方法。該研究以枯草芽孢桿菌為底盤細(xì)胞，首先將來(lái)源于Petromyzon marinus的胞嘧啶脫氨酶（PmCDA）和nCas9蛋白以新的方式融合后整合到底盤基因組，構(gòu)建出一種整合型高效堿基編輯器（CRISPR-CDA-nCas9-UGI）。該編輯器能夠在一個(gè)較寬的編輯窗口（15-20 nt）內(nèi)發(fā)生高效C→T轉(zhuǎn)換，編輯效率接近100%；編輯窗口寬度及編輯效率能夠通過(guò)誘導(dǎo)劑濃度、持續(xù)迭代等手段實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)，且可靶向多個(gè)基因以及單個(gè)基因的多個(gè)位點(diǎn)，這些特點(diǎn)保證了突變的高效性和突變體的多樣性。該編輯器適用于構(gòu)建蛋白質(zhì)原位突變體文庫(kù)，并從中篩選出合適的突變體?；谠撓到y(tǒng)研究者分別對(duì)膜蛋白復(fù)合體Sec轉(zhuǎn)運(yùn)酶和bacitracin抗性蛋白（BceB）展開體內(nèi)原位定向進(jìn)化，成功獲得了分泌效率提升3.6倍的突變株以及對(duì)bacitracin產(chǎn)生不同敏感度的突變株。經(jīng)過(guò)新一代高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)的脫靶率很低，表明系統(tǒng)具有極高的特異性。

 

　　本研究將基于CRISPR的堿基編輯系統(tǒng)和蛋白質(zhì)定向進(jìn)化相聯(lián)系，在CRISPR-Cas已有的基因插入、刪除及參與基因表達(dá)調(diào)控等功能之外，成功拓展出了新的應(yīng)用領(lǐng)域。研究不僅為復(fù)雜蛋白質(zhì)和蛋白復(fù)合體的功能進(jìn)化提供了新的技術(shù)，也為構(gòu)建含有進(jìn)化蛋白質(zhì)的底盤細(xì)胞提供了新的研究思路。

 

　　周哲敏教授為該論文的通訊作者，江南大學(xué)19級(jí)博士生郝文亮和我院崔文璟副教授為該論文的共同第一作者。上述研究工作得到了國(guó)際科技合作創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目（2017YFE0129600）、國(guó)家自然科學(xué)基金（21878125）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20181206）等項(xiàng)目的資助。