超低溫保存（cryopreservation）是在液氮（-196℃）中保存細(xì)胞、組織和器官的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、植物和微生物種質(zhì)資源的長(zhǎng)期保存。植物超低溫保存通常與離體培養(yǎng)技術(shù)（in vitro culture）相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)花粉、愈傷組織、體細(xì)胞胚、合子胚、種子、離體分生組織和休眠芽的長(zhǎng)期安全保存。重要農(nóng)作物和觀賞植物的超低溫保存技術(shù)較為成熟、全球馬鈴薯和香蕉的主要野生種和品種都實(shí)現(xiàn)了超低溫保存。

 

　　種質(zhì)庫(kù)是野生植物遷地保護(hù)（ex situ conservation）最有效和經(jīng)濟(jì)的手段。大部分野生植物的種子脫水后可以在低溫（-20℃）下長(zhǎng)期保存，其壽命得到大幅度延長(zhǎng)。一些植物的種子不耐受脫水而無(wú)法進(jìn)行低溫保存，通常被稱(chēng)作頑拗型（recalcitrant）種子。根據(jù)英國(guó)千年種子庫(kù)2018年在Nature Plants雜志發(fā)表的評(píng)論文章“Seed banking not an option for many threatened plants”，全球范圍有8%的植物產(chǎn)生頑拗型種子，但在極度瀕危（critically endangered）植物和樹(shù)種（tree species）中這一比例分別高達(dá)36%和33%。全球植物保護(hù)戰(zhàn)略（The Global Strategy for Plant Conservation）的目標(biāo)7要求對(duì)75%的瀕危物種實(shí)現(xiàn)遷地保護(hù)，這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)需要對(duì)植物超低溫保存技術(shù)的投入和支持。

 

　　水在結(jié)晶后體積變大。細(xì)胞水分在超低溫下形成大的結(jié)晶會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。第一代植物超低溫保存技術(shù)通過(guò)程序降溫（controlled rate cooling）誘導(dǎo)胞外結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞緩慢脫水，胞內(nèi)液體濃度和粘稠度提升，在超低溫下進(jìn)入玻璃化狀態(tài)（vitrification），避免了胞內(nèi)結(jié)晶而保證細(xì)胞存活。第一代超低溫保存技術(shù)僅適用于耐冷（cold hardy）植物。新的玻璃化超低溫技術(shù)以高濃度的植物玻璃化溶液（plant vitrification solution）處理細(xì)胞，在滲透脫水的同時(shí)，低溫保護(hù)劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部改變了細(xì)胞液體的熱力學(xué)性質(zhì)，快速降溫時(shí)可以實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)和胞外的玻璃化，保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整和再生能力。新一代植物超低溫保存技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)熱帶植物的保存，大大拓展了植物超低溫保存的范圍。

 

　　細(xì)胞膜是低溫傷害和滲透響應(yīng)的核心部位。玻璃化超低溫保存流程中，細(xì)胞經(jīng)受了劇烈和復(fù)雜的滲透和溫度變化，細(xì)胞的存活和死亡取決于細(xì)胞膜能否對(duì)上述脅迫做出有效響應(yīng)。長(zhǎng)期以來(lái)，細(xì)胞膜對(duì)超低溫過(guò)程的響應(yīng)機(jī)理沒(méi)有得到解析，這也制約了超低溫技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。近日，中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所種子生物學(xué)研究組的林亮博士，陳虹穎副研究員，Hugh W. Pritchard 研究員與李唯奇研究員合作，以木蘭科植物厚樸的胚性細(xì)胞的超低溫保存體系作為模型系統(tǒng)，采用脂類(lèi)組學(xué)分析方法，比較了12個(gè)不同超低溫處理的差異，揭示了細(xì)胞膜對(duì)玻璃化超低溫保存過(guò)程的響應(yīng)模式。結(jié)果顯示：滲透保護(hù)處理和復(fù)水處理兩個(gè)相對(duì)的過(guò)程，發(fā)生了磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰肌酸（PA）和磷脂酰甘油（PG）的頭基團(tuán)互換，進(jìn)行了細(xì)胞膜重塑。PVS溶液處理后，總脂水平顯著升高，為細(xì)胞將要經(jīng)歷的冷凍過(guò)程儲(chǔ)備了大量脂類(lèi)分子。該研究結(jié)果表明，膜脂重塑（lipid remodeling）和預(yù)防脂類(lèi)降解是PVS方法成功的關(guān)鍵。從膜脂分子的角度對(duì)基于PVS的植物超低溫機(jī)理進(jìn)行了解析，為改進(jìn)玻璃化超低溫保存技術(shù)，拓展植物超低溫保存的通用性和應(yīng)用范圍提供了新思路。上述研究成果以“Lipid Remodeling Confers Osmotic Stress Tolerance to Embryogenic Cells during Cryopreservation”為題，在線發(fā)表在生物學(xué)領(lǐng)域雜志International Journal of Molecular Sciences上。

 

　　該項(xiàng)研究工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金（NSFC 31770375，31500272），云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（2017AB001）， 云南地方學(xué)院聯(lián)合基金（2018FH001-029），中國(guó)西南野生生物種質(zhì)資源庫(kù)“交叉合作團(tuán)隊(duì)”開(kāi)放研究項(xiàng)目，山東省農(nóng)業(yè)良種項(xiàng)目的資助（Grant No.2019LZGC01801）。