近日，西北農(nóng)林科技大學(xué)羊遺傳改良與生物育種團隊王小龍教授聯(lián)合國內(nèi)多家單位在國際學(xué)術(shù)期刊《Nucleic Acids Research》發(fā)表了題為“Configuration of adaptable template RNA architectures to unfold the editable space of nuclease prime editor”的研究論文。團隊創(chuàng)新性地設(shè)計了兩種適配核酸酶引導(dǎo)編輯器的新型RNA架構(gòu)：ActRNA:t雙RNA系統(tǒng)和tsp-pegRNA單分子系統(tǒng)，并詳細敘述了驅(qū)動這些設(shè)計的推理過程，突破了現(xiàn)有引導(dǎo)編輯工具的空間限制。

 

　　引導(dǎo)編輯技術(shù)（PE）作為由CRISPR系統(tǒng)衍生的新一代基因編輯工具，可通過逆轉(zhuǎn)錄機制實現(xiàn)精準(zhǔn)的基因插入、刪除和堿基替換。然而傳統(tǒng)PE僅能在DNA切割位點下游的非靶鏈進行編輯，且編輯效率隨距離增加顯著降低，限制了其應(yīng)用潛力。針對這一難題，團隊提出了一種全新的“靶向鏈編輯”策略：設(shè)計“靶向鏈輔助模板RNA”（ActRNA:t），通過sgRNA誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，搭配ActRNA:t實現(xiàn)在切割位點上游的精準(zhǔn)編輯。

 

　　項目組通過設(shè)計靶向鏈編程pegRNA（tsp-pegRNA），將引導(dǎo)與編輯功能集成于一個單分子上，該系統(tǒng)在HEK293T細胞中實現(xiàn)17.8-39.7%的精準(zhǔn)編輯率，在HeLa、U2OS和HepG2等多種細胞系驗證了普適性，并成功模擬了TTR和ASS1基因的致病突變模型。

 

　　隨后，項目組進一步揭示了i53模塊通過促進DNA斷裂末端的5‘端切除機制，可顯著提升目標(biāo)鏈的可編輯性。聯(lián)合DNA-PK抑制劑AZD7648后，編輯效率最高可達到75.8%，平均編輯純度提升了約43倍。經(jīng)PacBio長讀長測序驗證，新系統(tǒng)未誘發(fā)大規(guī)?；蚪M缺失。

 

　　項目組首次揭示 i53模塊的協(xié)同機制：通過誘導(dǎo)DNA斷裂末端的5’端切除，暴露出靶向鏈的單鏈區(qū)域，使tsp-pegRNA的PBS序列得以結(jié)合并啟動逆轉(zhuǎn)錄。這一發(fā)現(xiàn)顛覆了傳統(tǒng)引導(dǎo)編輯器的單復(fù)合物作用范式，建立“切割-解離-再編輯”雙復(fù)合物模型。同時該系統(tǒng)顯著拓寬了PE編輯窗口，有效攻克傳統(tǒng)難編靶點的效率瓶頸，與傳統(tǒng)PE形成正交互補，實現(xiàn)對更廣泛人類基因組的高效精準(zhǔn)編輯，為基因編輯及動植物生物育種提供了高效的候選工具。

 

　　我校博士生陳平博和浙江大學(xué)博士后李向陽為論文共同第一作者，我校王小龍教授、南京大學(xué)劉江懷教授和浙江大學(xué)黃行許教授為論文通訊作者，研究得到了羊遺傳改良與生物育種團隊負責(zé)人陳玉林教授的大力支持。該研究得到國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系、陜西省兩鏈融合重大專項等項目資助。

 

　　原文鏈接：https://academic.oup.com/nar/article/53/11/gkaf522/8160308#