近日，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所微生物與酶工程科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)成功改造了植酸酶的熱穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)植酸酶耐受溫度高達(dá)100 °C。該研究擴(kuò)展了可用于工業(yè)應(yīng)用的植酸酶庫(kù)，揭示了酶結(jié)構(gòu)和耐熱性之間的復(fù)雜關(guān)系，為酶修飾相關(guān)研究奠定了理論基礎(chǔ)。相關(guān)研究進(jìn)展發(fā)表在《生物化學(xué)雜志（Journal of Biological Chemistry）》期刊。

 

　　提高酶的穩(wěn)定性對(duì)于擴(kuò)大生物技術(shù)的應(yīng)用范圍和提高其適應(yīng)能力至關(guān)重要。開(kāi)發(fā)能夠耐受高達(dá)100 ℃的高溫酶的不僅有助于推進(jìn)酶工程技術(shù)，而且拓寬了其在不同領(lǐng)域的潛在應(yīng)用。為了進(jìn)一步說(shuō)明這一概念，研究團(tuán)隊(duì)選擇了全球市場(chǎng)價(jià)值高達(dá)5.9億美元的植酸酶作為驗(yàn)證。通過(guò)深入分析晶體結(jié)構(gòu)并實(shí)施引入二硫鍵、進(jìn)行能量計(jì)算和B因子分析等策略，成功地實(shí)現(xiàn)了植酸酶的熱穩(wěn)定性理性設(shè)計(jì)。

 

　　Y. intermedia 植酸酶APPA因其理想的酶學(xué)性質(zhì)在飼料工業(yè)中顯示出巨大的應(yīng)用潛力，但是它在熱穩(wěn)定性方面不符合制粒過(guò)程中瞬時(shí)高溫處理的技術(shù)要求。研究團(tuán)隊(duì)最初采用定向進(jìn)化的方法來(lái)提高植酸酶APPA的特性，從隨機(jī)突變文庫(kù)中篩選出一個(gè)四點(diǎn)突變體APPAmut4，表現(xiàn)出與APPA相當(dāng)?shù)奶匦?，且表達(dá)量有所增加?？紤]到異源蛋白的高水平生產(chǎn)在基礎(chǔ)研究和工業(yè)應(yīng)用中的重要性和相關(guān)性，因此APPAmut4是通過(guò)利用基于結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的計(jì)算方法來(lái)提高其熱穩(wěn)定性的理想候選者。團(tuán)隊(duì)首先對(duì)APPAmut4進(jìn)行了晶體結(jié)構(gòu)解析，以確定其與野生型相比的差異結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)?；贏PPAmut4（PDB ID:8XM1）的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，采用三種理性設(shè)計(jì)策略來(lái)研究其增強(qiáng)熱穩(wěn)定性的分子設(shè)計(jì)。首先，團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了將二硫鍵引入APPAmut4的精確工程設(shè)計(jì)。其次，通過(guò)對(duì)APPAmut4突變體的展開(kāi)自由能分析構(gòu)建虛擬變體庫(kù)。第三，通過(guò)對(duì)APPAmut4晶體結(jié)構(gòu)中的B因子確定突變熱點(diǎn)。最后，通過(guò)這三種策略獲得的所有陽(yáng)性突變變體都被順序納入，以鑒定具有優(yōu)異熱穩(wěn)定性的突變體。

 

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　　基于APPAmut4結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的計(jì)算設(shè)計(jì)示意圖

 

　　通過(guò)迭代組合突變，成功獲得了一種突變體APPAmut9，它在保持酶活性的同時(shí)具有增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。在95℃下處理5分鐘后，它顯示出約80%的剩余活性，即使在100 ℃的沸水條件下暴露相同的時(shí)間，也能保持約70%的活性。APPAmut9顯示出在酶工程研究領(lǐng)域很少觀察到的超高熱彈性。

 

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　　APPAmut4熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的示意圖

 

　　酶的熱穩(wěn)定性在評(píng)估工業(yè)酶制劑的實(shí)用性方面至關(guān)重要，因?yàn)樗芗铀俜磻?yīng)過(guò)程，并通過(guò)其高穩(wěn)定性來(lái)降低生產(chǎn)成本。然而，大多數(shù)天然酶在高溫下容易變性，這凸顯了提高酶穩(wěn)定性以保持其功能的必要性。涂濤研究員通過(guò)創(chuàng)新的工程方法，深入探索了酶結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系，并運(yùn)用理性設(shè)計(jì)策略，帶領(lǐng)研究團(tuán)隊(duì)成功研發(fā)出一種能在100 ℃高溫下保持催化效率的超級(jí)植酸酶。這一成果突破了植酸酶在畜禽飼料中應(yīng)用的耐熱性局限，證明了抗沸煮工程植酸酶的可行性，同時(shí)也擴(kuò)大了適用于工業(yè)飼料生產(chǎn)的植酸酶種類。

 

　　中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所的涂濤研究員和黃火清研究員為該文章的共同通訊作者。研究得到了伊利諾伊大學(xué)厄巴納-香檳分校Isaac Cann教授和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)成艷芬教授的指導(dǎo)和幫助。該研究還得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委、肉雞體系和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程重大科研任務(wù)等項(xiàng)目的資助。

 

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　　https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925824024943?via%3Dihub