近日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室謝卡斌課題組建立了一種陣列式CRISPR文庫(kù)用于大規(guī)模植物基因編輯的方法。利用此方法，該課題組創(chuàng)建了靶向敲除1072個(gè)水稻類受體激酶的基因編輯材料，為快速鑒定抗病、抗逆相關(guān)的基因提供了新資源?；诖耍搱F(tuán)隊(duì)以“A FLASH pipeline for arrayed CRISPR library construction and the gene function discovery of rice receptor-like kinases”為題在Molecular Plant期刊上在線發(fā)表了研究論文。

 

　　隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在植物中的日益成熟，利用CRISPR文庫(kù)進(jìn)行高通量的遺傳篩選成為可能。目前有兩種 CRISPR 文庫(kù)構(gòu)建策略：混合型文庫(kù)（pooled library）和陣列式文庫(kù)（arrayed library）。其中，混合型的CRISPR/Cas9文庫(kù)已被多個(gè)實(shí)驗(yàn)室用于水稻、玉米、番茄等作物的突變體庫(kù)的構(gòu)建，但目前尚未有陣列式CRISPR文庫(kù)在植物中應(yīng)用的報(bào)道。

 

　　本研究建立了一種陣列式CRISPR庫(kù)的快速構(gòu)建技術(shù)，可同時(shí)用于小規(guī)模和大規(guī)模植物基因編輯材料的創(chuàng)制。作者設(shè)計(jì)了一種PCR片段長(zhǎng)度作為Cas9/gRNA載體標(biāo)簽的策略（PCR fragment-length markers for gRNAs distinguishing，簡(jiǎn)稱FLASH標(biāo)簽），可以通過(guò)常規(guī)PCR和凝膠電泳讀取每個(gè)載體和轉(zhuǎn)化植株的gRNA信息（即靶基因信息）。本研究中，課題組設(shè)計(jì)了12個(gè)含不同F(xiàn)LASH標(biāo)簽的CRISPR/Cas載體，并與96孔板高通量克隆技術(shù)結(jié)合，建立了快速構(gòu)建Cas9/gRNA質(zhì)粒文庫(kù)的方法。本研究還設(shè)計(jì)了將含不同F(xiàn)LASH標(biāo)簽的12個(gè)質(zhì)粒載體混合后轉(zhuǎn)化水稻的策略，通過(guò)PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化植株所含F(xiàn)LASH標(biāo)簽的片段大小即可讀取gRNA信息，極大地簡(jiǎn)化了基因編輯材料的創(chuàng)制過(guò)程。

 

　　利用FLASH策略，本研究在一年左右的時(shí)間內(nèi)完成了靶向編輯1072個(gè)水稻類受體激酶的構(gòu)建工作。課題組以12個(gè)載體混合轉(zhuǎn)化水稻的方式，通過(guò)89個(gè)水稻轉(zhuǎn)化事件獲得了5039棵T0代水稻植株；通過(guò)PCR檢測(cè)FLASH標(biāo)簽的方式讀取了每株植物的gRNA信息，成功獲得了955個(gè)RLK基因的編輯水稻。對(duì)部分材料的基因型鑒定結(jié)果表明，目標(biāo)基因的編輯效率在90%以上。

 

 

　　本研究對(duì)脫靶編輯、無(wú)T-DNA整合的基因編輯事件也進(jìn)行了詳細(xì)分析，并對(duì)15個(gè)基因的材料進(jìn)行了稻瘟病接種試驗(yàn)，鑒定到了9個(gè)抗稻瘟病相關(guān)的基因。最后，課題組討論了該方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并提出了構(gòu)建全基因組規(guī)模的陣列式CRISPR文庫(kù)的協(xié)作方案。

 

 

　　我校2021屆博士畢業(yè)生陳凱園為論文第一作者，謝卡斌教授為通訊作者；武漢大學(xué)侯昕教授、賓夕法尼亞州立大學(xué)Yang Yinong教授和我校熊立仲教授也參與了研究。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、科技部轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)自主創(chuàng)新基金等項(xiàng)目的資助。

 

　　【英文摘要】

 

　　Clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）？CRISPR-associated protein 9 （Cas9）-mediated gene editing is revolutionizing plant research and crop breeding. Here, we present an effective and streamlined pipeline for arrayed CRISPR library construction that is suitable for small- to large-scale genome editing in plants. This pipeline introduces artificial PCR fragment-length markers for guide RNAs （gRNAs） distinguishing （FLASH）， and a group of 12 constructs harboring different FLASH tags are co-transformed into plants each time. Therefore, the identities of gRNAs in Agrobacterium mixtures and transgenic plants can be read out through detecting the FLASH tags which only requires conventional PCR and gel electrophoresis rather than sequencing. We generated an arrayed CRISPR library targeting all 1,072 members of receptor-like kinases （RLKs） family of rice. One-shot transformation generated a mutant population covering gRNAs targeting 955 RLKs, and 74.3% （710/955） of target genes had 3 or more independent T0 lines. Our results indicate that the FLASH tags bona fide surrogate the gRNAs and tightly （92.1%） associate with frameshift mutations of target genes. Additionally, the FLASH pipeline allows rapid identification of unintended editing events without corresponding T-DNA integrations and generates high-order mutants of closely related RLK genes. We also showed that the RLK mutant library enables fast discovery of defense-related RLK genes. Together, this study provides an effective pipeline for arrayed CRISPR library construction and reports genome-wide mutant resources of rice RLKs for functional genomics.

 

　　論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.molp.2021.09.015