近日， 華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室李志敏教授課題組在酶工程方向取得新進展，有關成果在Chemical Engineering Journal以“Iterativeconformational dynamics-guided protein engineering reshapes biocatalystproperties for efficient and cost-effective cytidine 5'-monophosphateproduction” （https://doi.org/10.1016/j.cej.2021.131597）為題進行了報道。

 

　　基于分子-構象動力學模擬的虛擬篩選結合濕法實驗是獲得目標蛋白質的一種有吸引力的方法。然而，傳統(tǒng)的構象動力學可能無法最大程度地篩選影響酶性能的關鍵殘基，導致蛋白質改造成功率低。為了獲得盡可能多且可靠性高的關鍵殘基，作者提出了一種迭代構象動力學分析（ICDA）策略。ICDA不僅考慮溫度對蛋白整體的影響，而且還結合殘基之間相互作用，可提高突變文庫質量。

 

　　作者前期構建了嗜極酶耦聯(lián)生產胞苷酸體系（Li et al. J. Agr. FoodChem. 2020），基于該體系驗證了ICDA方法。通過多代丙氨酸掃描和動力學模擬，快速確定了體系中胞苷激酶的24個核心殘基。在模擬結果的指導下，進一步選擇了5個殘基進行深入分析，得到2個關鍵殘基（A220和A248）和15個突變，并通過實驗和計算評估所有突變體。其中A220L變體催化底物胞苷的活性增加了7.3倍，A248S的kcat/Km增加了3.5倍。兩個變體均可替換野生型胞苷激酶，通過嗜極酶耦聯(lián)體系在5小時內將400 mM胞苷完全轉化為胞苷酸，平均生產速率較原始水平提高了4倍。

 

　　為了證明ICDA的普遍適用性，作者還研究了耦聯(lián)體系中的多聚磷酸激酶，通過對多聚磷酸激酶執(zhí)行ICDA分析，快速確定了17個關鍵殘基，并選擇其中三個殘基（E40、V72和A98）進行飽和突變，得到57個突變體。選擇10個均方根波動發(fā)生顯著變化的多聚磷酸激酶突變體用于全細胞催化實驗。結果表明，V72T變體可催化三聚磷酸鹽和ADP生成ATP的反應。使用多聚磷酸激酶變體與胞苷激酶變體耦聯(lián)，不僅提高了胞苷酸的生產效率，而且降低了成本。這些結果有力地支持了ICDA方法的適用性。相關研究結果均已申請專利（專利申請?zhí)?02110403969.3和202110404992.4）。

 

　　上述論文第一作者為我校生物工程學院在讀博士生李宗霖，通訊作者為李志敏教授。研究工作得到了天津市合成生物技術創(chuàng)新能力提升項目（TSBICIP-KJGG-009）和國家重點研發(fā)計劃（2019YFA0904300）資助。