暨南大學(xué)理工學(xué)院汪勇教授課題組的碩士研究生劉雪在Food Chemistry期刊（中科院JCR 1區(qū)，影響因子6.306）發(fā)表了一篇關(guān)于應(yīng)用制備型高效液相同時(shí)分離制備12種亞麻籽環(huán)肽單體研究的文章。論文標(biāo)題為“A practical and fast isolation of 12 cyclolinopeptides （linusorbs） from flaxseed oil via preparative HPLC with phenyl-hexyl column”，蔡子哲副研究員為共同第一作者，張寧教授和汪勇教授指導(dǎo)并共為通訊作者。

 

　　研究背景：

 

　　亞麻籽，我國(guó)第四大油料作物，其不僅富含油脂、蛋白質(zhì)、50%的ω-3必需脂肪酸：α-亞麻酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還富含木酚素，亞麻籽膠，環(huán)肽等特殊成分。環(huán)肽是一組從亞麻籽油中衍生的環(huán)狀疏水肽，由八個(gè)或九個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為1 kDa。與普通直鏈小分子肽相比，環(huán)肽化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定，具有廣譜、高效的抗菌活性，能抗腫瘤，消炎，以及抗癌等作用，且具有高效的生物活性，其健康益處不斷被揭示。目前環(huán)肽制備主要分為四種：a）硅膠柱層析法；b）化學(xué)合成法；c）溶劑萃取法；d）液相制備法；然而硅膠法操作復(fù)雜，溶劑用量大，純度監(jiān)控難；化學(xué)合成法路線復(fù)雜，副產(chǎn)物多，純化困難，得率低；溶劑萃取法溶劑用量大，產(chǎn)量低，產(chǎn)物為多種環(huán)肽混合物；液相制備法僅用于1-2種環(huán)肽制備，其他環(huán)肽存在出峰重疊問(wèn)題?，F(xiàn)階段亞麻籽環(huán)肽純化方法的不足，阻礙了進(jìn)一步對(duì)其他環(huán)肽的生理活性的研究。因此本研究主要探討開發(fā)一種基于制備型HPLC同時(shí)分離環(huán)肽單體的實(shí)用方法以供后續(xù)生物活性研究參考。

 

　　研究方法：

 

　　本研究應(yīng)用制備型高效液相色譜法進(jìn)行環(huán)肽制備，對(duì)比了兩種不同制備柱型對(duì)于環(huán)肽分離制備的影響以及為了達(dá)到制備分離所需的最佳樣品濃度，對(duì)粗環(huán)肽在不同溶劑中的溶解度進(jìn)行了測(cè)定，并進(jìn)行了相應(yīng)的評(píng)價(jià)。為了確保純度和效率，優(yōu)化了一系列參數(shù)，例如梯度設(shè)置，樣品進(jìn)樣量，進(jìn)樣濃度等。并通過(guò)離線ESI-MS和純度測(cè)試最終確認(rèn)氨基酸殘基序列。

 

　　研究結(jié)果及結(jié)論：

 

　　開發(fā)了一種新穎的制備型高效液相色譜（HPLC）方法，可同時(shí)分離出12種環(huán)肽單體，包括CLF, CLG, CLC, CLE, CLN, CLN*, CLB,CLA, CLP, CLL, CLM和CLO。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化最佳條件為：初始ACN（乙腈）比率（在水中）為40％，最終ACN比例為80％，流速16 mL/min，進(jìn)樣量12.5 mg，進(jìn)樣濃度80 mg/mL，分析時(shí)間21 min。經(jīng)分析液相確定，所純化化合物純度高于95.5%。在最佳的制備型HPLC條件下，可以純化超過(guò)10 mg的主要環(huán)肽，而對(duì)于次要環(huán)肽，從10次進(jìn)樣后的收率也高于1 mg。這使得結(jié)構(gòu)確認(rèn)，結(jié)構(gòu)修飾和更大范圍的生物活性規(guī)模測(cè)定成為可能。同時(shí)，每種制備方法的運(yùn)行時(shí)間已大大減少到約20 min，這對(duì)于使用傳統(tǒng)液相儀器進(jìn)行高通量制備提供了可行性。同時(shí)經(jīng)過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜確認(rèn)鑒定，總結(jié)出了環(huán)肽化合物的碎裂規(guī)律及核對(duì)了環(huán)肽化合物的結(jié)構(gòu)。所建立的方法，可以用于環(huán)肽單體的高效純化，得到的環(huán)肽單體純度高，質(zhì)量好，可為將來(lái)的環(huán)肽成產(chǎn)及進(jìn)一步的生物活性評(píng)價(jià)提供一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

 

　　研究工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFE0108400和2018YFD0401103），國(guó)家自然科學(xué)基金（31920103012和31901603），中國(guó)博士后科學(xué)基金（2019M663386），以及廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201903010049）等的支持資助。

 

　　參考文獻(xiàn)：

 

　　Liu, X, Cai, Z.Z., Lee, W. J., Lu, X. X., Martin J.T. Reaney, Zhang, J. P., Zhang, N. , & Wang, Y. A practical and fast isolation of 12 cyclolinopeptides （linusorbs） from flaxseed oil via preparative HPLC with phenyl-hexyl column. Food Chemistry, 2021, 351: 129318.

 

　　原文鏈接：http://doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.129318

 

　　作者簡(jiǎn)介：

 

　　張寧，博士，暨南大學(xué)教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事食品生物技術(shù)和油料生物煉制方向的研究，已發(fā)表核心期刊以上論文80余篇，其中SCI文章10余篇。近5年主持國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃國(guó)際合作項(xiàng)目1項(xiàng)，省部級(jí)項(xiàng)目3項(xiàng)，主要參與國(guó)家級(jí)項(xiàng)目3項(xiàng)。參與授權(quán)國(guó)內(nèi)專利2項(xiàng)，美國(guó)專利1項(xiàng)。獲得2018年廣東省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)（第5），2017年糧油學(xué)會(huì)科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)（第7），2016年中國(guó)食品科技學(xué)會(huì)科技創(chuàng)新獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)（第6）。

 

　　蔡子哲，博士，暨南大學(xué)副研究員，本科為暨南大學(xué)國(guó)際學(xué)院食品質(zhì)量與安全2012級(jí)畢業(yè)生，博士畢業(yè)于中山大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)，薩斯喀徹溫大學(xué)農(nóng)學(xué)院訪問(wèn)學(xué)者。目前從事油料作物及其副產(chǎn)物的高值化加工和營(yíng)養(yǎng)因子的制備分離研究。以第一作者（或通訊作者）發(fā)表SCI文章7篇，申請(qǐng)發(fā)明專利3項(xiàng)。目前主持國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目，中國(guó)博士后基金面上項(xiàng)目各一項(xiàng)。

 

　　劉雪，暨南大學(xué)理工學(xué)院2018級(jí)食品系碩士，研究亞麻籽中環(huán)肽的高效制備及環(huán)肽的抗衰老功效評(píng)價(jià)。研究興趣包括基于木酚素和環(huán)肽的亞麻籽粕高值化研究，亞麻籽中營(yíng)養(yǎng)成分木酚素和環(huán)肽的制備分析，熟練掌握制備型高效液相、分析液相、質(zhì)譜分析、光柵型多功能微孔板檢測(cè)儀等。