暨南大學(xué)理工學(xué)院汪勇教授課題組的碩士研究生劉雪在Food Chemistry期刊(中科院JCR 1區(qū),影響因子6.306)發(fā)表了一篇關(guān)于應(yīng)用制備型高效液相同時(shí)分離制備12種亞麻籽環(huán)肽單體研究的文章。論文標(biāo)題為“A practical and fast isolation of 12 cyclolinopeptides (linusorbs) from flaxseed oil via preparative HPLC with phenyl-hexyl column”,蔡子哲副研究員為共同第一作者,張寧教授和汪勇教授指導(dǎo)并共為通訊作者。
研究背景:
亞麻籽,我國(guó)第四大油料作物,其不僅富含油脂、蛋白質(zhì)、50%的ω-3必需脂肪酸:α-亞麻酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),還富含木酚素,亞麻籽膠,環(huán)肽等特殊成分。環(huán)肽是一組從亞麻籽油中衍生的環(huán)狀疏水肽,由八個(gè)或九個(gè)氨基酸殘基組成,分子量約為1 kDa。與普通直鏈小分子肽相比,環(huán)肽化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定,具有廣譜、高效的抗菌活性,能抗腫瘤,消炎,以及抗癌等作用,且具有高效的生物活性,其健康益處不斷被揭示。目前環(huán)肽制備主要分為四種:a)硅膠柱層析法;b)化學(xué)合成法;c)溶劑萃取法;d)液相制備法;然而硅膠法操作復(fù)雜,溶劑用量大,純度監(jiān)控難;化學(xué)合成法路線復(fù)雜,副產(chǎn)物多,純化困難,得率低;溶劑萃取法溶劑用量大,產(chǎn)量低,產(chǎn)物為多種環(huán)肽混合物;液相制備法僅用于1-2種環(huán)肽制備,其他環(huán)肽存在出峰重疊問(wèn)題?,F(xiàn)階段亞麻籽環(huán)肽純化方法的不足,阻礙了進(jìn)一步對(duì)其他環(huán)肽的生理活性的研究。因此本研究主要探討開發(fā)一種基于制備型HPLC同時(shí)分離環(huán)肽單體的實(shí)用方法以供后續(xù)生物活性研究參考。
研究方法:
本研究應(yīng)用制備型高效液相色譜法進(jìn)行環(huán)肽制備,對(duì)比了兩種不同制備柱型對(duì)于環(huán)肽分離制備的影響以及為了達(dá)到制備分離所需的最佳樣品濃度,對(duì)粗環(huán)肽在不同溶劑中的溶解度進(jìn)行了測(cè)定,并進(jìn)行了相應(yīng)的評(píng)價(jià)。為了確保純度和效率,優(yōu)化了一系列參數(shù),例如梯度設(shè)置,樣品進(jìn)樣量,進(jìn)樣濃度等。并通過(guò)離線ESI-MS和純度測(cè)試最終確認(rèn)氨基酸殘基序列。
研究結(jié)果及結(jié)論:
開發(fā)了一種新穎的制備型高效液相色譜(HPLC)方法,可同時(shí)分離出12種環(huán)肽單體,包括CLF, CLG, CLC, CLE, CLN, CLN*, CLB,CLA, CLP, CLL, CLM和CLO。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化最佳條件為:初始ACN(乙腈)比率(在水中)為40%,最終ACN比例為80%,流速16 mL/min,進(jìn)樣量12.5 mg,進(jìn)樣濃度80 mg/mL,分析時(shí)間21 min。經(jīng)分析液相確定,所純化化合物純度高于95.5%。在最佳的制備型HPLC條件下,可以純化超過(guò)10 mg的主要環(huán)肽,而對(duì)于次要環(huán)肽,從10次進(jìn)樣后的收率也高于1 mg。這使得結(jié)構(gòu)確認(rèn),結(jié)構(gòu)修飾和更大范圍的生物活性規(guī)模測(cè)定成為可能。同時(shí),每種制備方法的運(yùn)行時(shí)間已大大減少到約20 min,這對(duì)于使用傳統(tǒng)液相儀器進(jìn)行高通量制備提供了可行性。同時(shí)經(jīng)過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜確認(rèn)鑒定,總結(jié)出了環(huán)肽化合物的碎裂規(guī)律及核對(duì)了環(huán)肽化合物的結(jié)構(gòu)。所建立的方法,可以用于環(huán)肽單體的高效純化,得到的環(huán)肽單體純度高,質(zhì)量好,可為將來(lái)的環(huán)肽成產(chǎn)及進(jìn)一步的生物活性評(píng)價(jià)提供一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
研究工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2018YFE0108400和2018YFD0401103),國(guó)家自然科學(xué)基金(31920103012和31901603),中國(guó)博士后科學(xué)基金(2019M663386),以及廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201903010049)等的支持資助。
參考文獻(xiàn):
Liu, X, Cai, Z.Z., Lee, W. J., Lu, X. X., Martin J.T. Reaney, Zhang, J. P., Zhang, N. , & Wang, Y. A practical and fast isolation of 12 cyclolinopeptides (linusorbs) from flaxseed oil via preparative HPLC with phenyl-hexyl column. Food Chemistry, 2021, 351: 129318.
原文鏈接:http://doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.129318
作者簡(jiǎn)介:
張寧,博士,暨南大學(xué)教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事食品生物技術(shù)和油料生物煉制方向的研究,已發(fā)表核心期刊以上論文80余篇,其中SCI文章10余篇。近5年主持國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃國(guó)際合作項(xiàng)目1項(xiàng),省部級(jí)項(xiàng)目3項(xiàng),主要參與國(guó)家級(jí)項(xiàng)目3項(xiàng)。參與授權(quán)國(guó)內(nèi)專利2項(xiàng),美國(guó)專利1項(xiàng)。獲得2018年廣東省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)(第5),2017年糧油學(xué)會(huì)科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)(第7),2016年中國(guó)食品科技學(xué)會(huì)科技創(chuàng)新獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)(第6)。
蔡子哲,博士,暨南大學(xué)副研究員,本科為暨南大學(xué)國(guó)際學(xué)院食品質(zhì)量與安全2012級(jí)畢業(yè)生,博士畢業(yè)于中山大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué),薩斯喀徹溫大學(xué)農(nóng)學(xué)院訪問(wèn)學(xué)者。目前從事油料作物及其副產(chǎn)物的高值化加工和營(yíng)養(yǎng)因子的制備分離研究。以第一作者(或通訊作者)發(fā)表SCI文章7篇,申請(qǐng)發(fā)明專利3項(xiàng)。目前主持國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目,中國(guó)博士后基金面上項(xiàng)目各一項(xiàng)。
劉雪,暨南大學(xué)理工學(xué)院2018級(jí)食品系碩士,研究亞麻籽中環(huán)肽的高效制備及環(huán)肽的抗衰老功效評(píng)價(jià)。研究興趣包括基于木酚素和環(huán)肽的亞麻籽粕高值化研究,亞麻籽中營(yíng)養(yǎng)成分木酚素和環(huán)肽的制備分析,熟練掌握制備型高效液相、分析液相、質(zhì)譜分析、光柵型多功能微孔板檢測(cè)儀等。
