近日，Nucleic Acids Research在線發(fā)表了江南大學(xué)未來(lái)食品科學(xué)中心和生物工程學(xué)院陳堅(jiān)院士團(tuán)隊(duì)劉龍教授課題組的研究成果“A pathway independent multi-modular ordered control system based on thermosensors and CRISPRi improves bioproduction in Bacillus subtilis”（Yu et al., Nucleic Acids Research. 2022. 50, 11: 6587-6600）。江南大學(xué)2019級(jí)博士生于文文為論文第一作者，劉龍教授為論文通訊作者。

 

　　合成生物學(xué)與代謝工程的一個(gè)主要目標(biāo)是構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠進(jìn)行化學(xué)品的高效生產(chǎn)，其關(guān)鍵是如何實(shí)現(xiàn)微生物代謝網(wǎng)絡(luò)代謝流的最優(yōu)分配?；蚧芈房梢杂行胶饧?xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成模塊的代謝流競(jìng)爭(zhēng)，緩解胞內(nèi)代謝壓力。然而目前大部分基因回路只能同時(shí)激活/抑制靶向模塊，無(wú)法實(shí)現(xiàn)多個(gè)代謝模塊的獨(dú)立、正交和時(shí)序調(diào)控。此外，大多數(shù)胞內(nèi)代謝物缺乏與之對(duì)應(yīng)的生物傳感器，這極大限制了基因回路的普適性。

 

　　為解決上述難題，該研究在模式工業(yè)微生物枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中創(chuàng)制了溫敏型多模塊時(shí)序雙向調(diào)控系統(tǒng)，并將其應(yīng)用于2'-巖藻糖基乳糖（2'-FL）的代謝網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化。首先，利用大腸桿菌噬菌體中溫敏型轉(zhuǎn)錄因子突變體CI857的調(diào)控機(jī)制，設(shè)計(jì)并創(chuàng)制了多個(gè)不同激活點(diǎn)（30、32、34與37℃）的溫敏型生物傳感器。其次，將多個(gè)不同激活點(diǎn)的溫敏型生物傳感器進(jìn)行聯(lián)用，構(gòu)建了一種可以對(duì)多代謝模塊進(jìn)行時(shí)序激活調(diào)控的單輸入多輸出（SIMO）基因回路，并對(duì)該基因回路的正交性與功能性進(jìn)行了驗(yàn)證。隨后，將溫敏型生物傳感器與基于CRISPRi的邏輯“非”門進(jìn)行耦合，構(gòu)建了一種可以對(duì)不同代謝模塊進(jìn)行激活與抑制的雙功能基因回路，并對(duì)該基因回路進(jìn)行了功能驗(yàn)證。

 

　　在上述研究基礎(chǔ)上，在B. subtilis內(nèi)重構(gòu)了2'-FL代謝途徑，并將其分為3個(gè)模塊：2'-FL合成模塊、GTP供給模塊、競(jìng)爭(zhēng)途徑模塊。利用激活點(diǎn)為34℃的溫敏型生物傳感器構(gòu)建激活回路并應(yīng)用至2'-FL合成模塊，通過(guò)對(duì)不同靶點(diǎn)基因的組合優(yōu)化控制，2'-FL的搖瓶產(chǎn)量提高至755.0 mg/L；利用激活點(diǎn)為37℃的溫敏型生物傳感器，構(gòu)建抑制回路動(dòng)態(tài)下調(diào)糖酵解途徑與磷酸戊糖途徑，實(shí)現(xiàn)了2'-FL合成模塊與競(jìng)爭(zhēng)模塊解偶聯(lián)時(shí)序調(diào)控。通過(guò)組裝不同強(qiáng)度的抑制位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了代謝流的最優(yōu)調(diào)控，2'-FL的產(chǎn)量達(dá)到1399.5 mg/L。在此基礎(chǔ)上，利用激活點(diǎn)為34℃的溫敏型生物傳感器，將GTP供給模塊與2'-FL合成模塊偶聯(lián)激活，2'-FL的產(chǎn)量進(jìn)一步提高至1839.7 mg/L。最后，在5-L發(fā)酵罐上對(duì)該調(diào)控系統(tǒng)的穩(wěn)定性與魯棒性進(jìn)行了驗(yàn)證，2'-FL的產(chǎn)量達(dá)到了28.2 g/L。

 

　　上述研究工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2021YFD2100700）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31930085, 32021005）、中央高校基本科研專項(xiàng)資金（JUSRP52019A, JUSRP121010, JUSRP221013）等項(xiàng)目的資助。