近日，中國農(nóng)科院植保所作物病原生物功能基因組研究創(chuàng)新團隊在國際知名期刊《植物生理學(xué)》（Plant Physiology）在線發(fā)表了題為“T-LOC: a comprehensive tool to localize and characterize the T-DNA integration sites”的論文，該研究開發(fā)了一個分析T-DNA插入位點分子特征的流程T-LOC。

 

　　農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化是植物基因工程的核心技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科研和遺傳育種研究。T-DNA在植物基因組中的插入位點以及插入到基因組的T-DNA數(shù)目都是隨機的，且插入的T-DNA片段經(jīng)常會突破左右邊界的限制。此外，通過其它方法包括基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體融合、花粉管通道法轉(zhuǎn)化等產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的外源DNA片段的具有類似的特性。轉(zhuǎn)基因植物的分子特征（T-DNA插入位點、插入拷貝數(shù)、插入序列、以及對基因組造成的變化等）是轉(zhuǎn)基因植物安全評價的主要內(nèi)容和核心，同時也是影響轉(zhuǎn)基因植物性狀的重要指標(biāo)。傳統(tǒng)上，southern雜交、熒光定量實時PCR可以用來評估T-DNA的拷貝數(shù)，基于PCR的染色體步移技術(shù)（TAIL-PCR, Adapter-PCR）經(jīng)常被用來分離T-DNA的插入位點，但是上述方法只適用于T-DNA插入片段比較簡單的轉(zhuǎn)基因植物，且操作復(fù)雜、耗時較長。

 

　　轉(zhuǎn)基因植物的高通量基因組測序數(shù)據(jù)已開始被應(yīng)用于評價轉(zhuǎn)基因植物的T-DNA插入片段的分子特征，目前已經(jīng)開發(fā)TDNAscan，但是在多種T-DNA插入情況下，TDNAscan不能正確評估T-DNA插入位點，同時TDNAscan不能評估轉(zhuǎn)基因?qū)χ参锘蚪M造成的變化。該論文開發(fā)了分析T-DNA插入位點的流程T-LOC （https://github.com/sfli001/T-LOC）。利用全基因組測序數(shù)據(jù)、植物基因組序列和轉(zhuǎn)基因載體序列，T-LOC輸出轉(zhuǎn)基因組植物的所有T-DNA插入位點分子特征信息：包括T-DNA插入位點模式圖、T-DNA和植物基因組嵌合測序read序列、植物基因組插入位點測序reads分布圖、以及T-DNA插入位點上下游1kb植物基因組和載體序列。

 

　　利用48個轉(zhuǎn)基因水稻植株的全基因組測序數(shù)據(jù)，研究人員對T-LOC的性能進行了全面的評估。T-LOC從48株水稻中分離到了75個完整的T-DNA插入位點（含左、右T-DNA插入位點），包括左右邊界定義的單個T-DNA、串聯(lián)或倒置重復(fù)的T-DNA、帶或者不帶抗性篩選標(biāo)記的截短T-DNA、攜帶T-DNA左右邊界之外的T-DNA骨架、多個完整和截短的T-DNA串聯(lián)體、T-DNA插入片段和轉(zhuǎn)基因植物之間的超短片段DNA等。研究人員還發(fā)現(xiàn)了T-DNA片段可以與農(nóng)桿菌的質(zhì)粒DNA片段融合后插入植物基因組。T-DNA插入植物基因組的同時，會引起植物基因組的變化，包括植物基因組的短片段缺失、基因組片段復(fù)制、植物基因組完美修復(fù)、和植物染色體重排，T-LOC可以提供轉(zhuǎn)基因植物基因組的變化。研究人員對這些研究結(jié)果通過PCR擴增、sanger 測序和Nanopore長read測序進行了驗證，進一步證明了T-LOC是分析轉(zhuǎn)基因作物插入位點分子特征的有效工具。

 

　　中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所李少芳博士和周煥斌博士為該論文的共同通訊作者，李少芳博士和本科實習(xí)生王晨陽為共同第一作者。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所周雪平教授和復(fù)旦大學(xué)尤辰江博士也參與了該項研究。該研究得到中央公益性科研機構(gòu)基礎(chǔ)研究基金項目資等項目的資助。