近日，西南大學(xué)柑桔研究所質(zhì)檢中心焦必寧研究員團隊在國際期刊Food Chemistry發(fā)表題為“CRISPRCas12a based fluorescence assay for organophosphorus pesticides in agricultural products”的研究論文（https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.132919）。我所碩士研究生付瑞杰為文章第一作者，焦必寧研究員和何悅教授為文章共同通訊作者。本研究得到國家重點研發(fā)項目課題和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（柑橘）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系等項目資助。

 

　　在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，有機磷農(nóng)藥被廣泛用于防治植物病蟲草害，對農(nóng)業(yè)增產(chǎn)有益。但不恰當(dāng)?shù)氖褂脮Νh(huán)境造成污染，對人和動物造成危害。有機磷農(nóng)藥屬于一種神經(jīng)毒物，可對人和動物體內(nèi)中樞神經(jīng)的乙酰膽堿酯酶（AChE）活性產(chǎn)生不可逆的抑制作用，從而引起神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的累積，造成神經(jīng)功能的紊亂。因此，對農(nóng)產(chǎn)品中的有機磷農(nóng)藥殘留進行快速、靈敏、準確的檢測，對維護食品安全和農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

 

　　近期，作為新一代基因編輯技術(shù)的CRISPR-Cas12a在核酸診斷領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用前景。Cas12a 蛋白在同源CrRNA 識別靶標(biāo)DNA 之后，不僅能特異性地切割靶標(biāo)DNA，還可非特異性地切割周圍任何單鏈DNA（ssDNA）。CRISPR-Cas12a系統(tǒng)具有具有精準切割、價格低廉、功能強大、便于操作等顯著優(yōu)點，現(xiàn)已被科學(xué)家創(chuàng)新性地引入到核酸快速檢測領(lǐng)域，成為現(xiàn)有核酸診斷技術(shù)的巨大突破。得益于CRISPR-Cas12a高效的酶切活性，加之與各種DNA 擴增技術(shù)相結(jié)合，使得CRISPR-Cas12a 系統(tǒng)對DNA 的檢測靈敏度低至aM水平。然而，將CRISPR-Cas12a應(yīng)用于有機磷農(nóng)藥殘留檢測還未見報道。

 

　　為了實現(xiàn)這個目標(biāo)，該工作創(chuàng)新性地將對有機磷農(nóng)藥的特異性識別事件轉(zhuǎn)化為對CRISPR-Cas12a的酶切活性調(diào)控事件，提出了一種基于雙酶級聯(lián)催化調(diào)控CRISPR-Cas12a 酶切活性的熒光檢測新方法，實現(xiàn)了有機磷農(nóng)藥的靈敏檢測。在最優(yōu)條件下，該方法對對氧磷、敵敵畏和內(nèi)吸磷的檢出限分別為270、406 和218 pg/mL。在柑橘類水果和卷心菜樣品中三個加標(biāo)濃度水平下，其平均回收率為96.43~100.85%，相對標(biāo)準偏差 （RSD, n=3） 低于5.6%。在該工作中，MnO2納米片及Mn2+依賴的DNAzyme成為了銜接有機磷農(nóng)藥特異性識別與CRISPR-Cas12a酶切活性的橋梁，首次實現(xiàn)了CRISPR-Cas12a在農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域的應(yīng)用。得益于MnO2納米片優(yōu)異的物理性能和三輪酶促信號放大策略的有機結(jié)合，該方法在農(nóng)產(chǎn)品中有機磷農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域呈現(xiàn)出較好的應(yīng)用潛力。