遺傳與變異是物種進化的基礎。通過物理、化學方法（如輻射誘變、EMS誘變）產生全基因組的隨機突變已經成為農作物育種的常規(guī)手段，但其中具有新型農藝性狀突變體的篩選較為費時、費力。定向進化（Directed Evolution）則通過創(chuàng)制目標基因的突變文庫，在施加一定選擇壓力下能夠快速獲得目的突變體。目前，植物基因的定向進化通常先通過易錯PCR、DNA合成或DNA重組等方法在體外產生目標基因的突變文庫，再轉化到大腸桿菌或酵母中進行功能篩選。然而，由于離開原始的基因組和細胞環(huán)境，篩選出來的基因突變可能并不能完全反映出它在植物中的真實功能。更重要的是，大多數重要農藝性狀無法在大腸桿菌或酵母中進行篩選。因此，建立一種在植物原位進行基因飽和突變和功能篩選的定向進化新方法將有助于加快植物育種及重要功能基因研究的進程。近日，中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所高彩霞研究組和李家洋研究組合作，構建了新型的飽和靶向內源基因突變堿基編輯器STEME，并在植物中實現了基因的定向進化和功能篩選。
研究者將胞嘧啶脫氨酶APOBEC3A和腺嘌呤脫氨酶ecTadA-ecTadA7.10同時融合在nCas9 （D10A）的N端，并將抑制體內尿嘧啶糖基化酶UDG的活性的UGI以融合或自由表達的形式置于nCas9 （D10A）的C端，共構建了4種形式的雙堿基編輯器STEME（STEME-1至STEME-4）。STEME雙堿基編輯器均可以只在一個sgRNA引導下就可以誘導靶位點C>T和A>G的同時突變，顯著增加了靶基因堿基突變的飽和度及產生突變類型的多樣性。STEME-1在水稻原生質體中C>T誘導效率高達61.61%，C>T和A>G同時突變的效率也高達15.50%。為了提高靶基因的堿基覆蓋度，研究者進一步利用能夠識別NG PAM的變體Cas9-NG構建了第5個雙堿基編輯器STEME-NG，發(fā)現只需要20個sgRNA就可以對OsACC上編碼56個氨基酸的序列實現近飽和的突變。
為了展示STEME在植物中的定向進化能力，研究者設計了靶向OsACC羧基轉移酶結構域上400個氨基酸編碼序列的200個獨立的sgRNA，分別構建到STEME-1或STEME-NG雙元載體上。將構建好的雙元載體分為27個轉化組，每個組內混合了等分子量的4至11個sgRNA載體，覆蓋80-142 bp的靶DNA區(qū)域，便于提高轉化效率和突變的高通量測序。經農桿菌介導法轉化水稻愈傷，共獲得約6000株水稻再生苗。水培法煉苗10天后，對再生苗噴灑高效氟吡甲禾靈（Haloxyfop）進行篩選，共發(fā)現四個除草劑抗性突變位點：P1927F、W2125C、S1866F和A1884P。除W2125C以外，其余三個抗性位點未曾在植物中有過報道。其中，P1927F與W2125C突變一樣表現出強除草劑抗性，具有較高的生產應用潛能?；谕吹鞍捉Y構模型分析發(fā)現，這些氨基酸突變直接或間接地影響了除草劑結合口袋的構象，從而降低了其對除草劑分子的結合能力而獲得除草劑抗性。
STEME技術體系的建立，對于原位（In situ）定向進化植物的內源功能基因提供了新型技術支撐，對農作物分子設計育種具有重要意義。此外，STEME系統(tǒng)還有望應用于不同細胞系、酵母或動物中的非編碼區(qū)的順式作用元件的調控、動物致病SNV的修正和抗藥位點的篩選等。該研究成果于2020年1月13日在線發(fā)表于《自然-生物技術》（Nature Biotechnology）雜志（DOI:10.1038/s41587-019-0393-7）。高彩霞研究組博士生李超、助理研究員張瑞以及李家洋研究組副研究員孟祥兵為本文共同第一作者，研究員高彩霞和李家洋為共同通訊作者。遺傳發(fā)育所陳宇航研究組和中科院微生物研究所邱金龍研究組參與了部分研究工作。該研究得到中科院戰(zhàn)略性先導專項、國家自然基金委等的經費資助。
圖：（a） STEME介導的雙堿基（C>T和A>G）編輯策略。（b） STEME-1介導的堿基編輯產物類型分布。（c） 利用STEME系統(tǒng)飽和突變OsACC CT結構域流程圖。（d） STEME系統(tǒng)介導的OsACC氨基酸替換產生除草劑抗性。
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